重楼皂苷对胰腺癌PANC1细胞增殖

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摘要：目的研究重楼皂苷Ⅶ对人胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移与侵袭作用及机制。方法采用MTT法检测重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞存活率的影响；观察重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞形态的影响；采用划痕实验和Transwell小室法考察重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞迁移和侵袭能力的影响；采用流式细胞术检测重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞凋亡的影响；采用Westernblotting法检测重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、B细胞淋巴瘤-2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-associatedXprotein，Bax）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（polyADP-ribosepolymerase，PARP）、DNA酶抑制物（inhibitorofcaspase-activateddeoxyribonuclease，ICAD）和程序性死亡分子配体-1（programmeddeathligand1，PD-L1）蛋白表达的影响。结果重楼皂苷Ⅶ可抑制PANC-1细胞存活率，显著抑制PANC-1细胞迁移和侵袭能力（P＜0.01），显著诱导PANC-1细胞凋亡（P＜0.05、0.01），显著升高PANC-1细胞中凋亡相关蛋白CleavedCaspase-3、PARP、Bax表达水平（P＜0.01），显著降低pro-PARP、ICAD、Bcl-2、PD-L1蛋白表达水平（P＜0.05、0.01）。结论重楼皂苷Ⅶ能够抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭，并可能通过下调PD-L1表达诱导PANC-1细胞凋亡。

胰腺癌发病率位居肿瘤第10位，死亡率位居第4位，患者的5年生存率仅有9%[1]。年我国新增约8.36万胰腺癌新发病例和8.51万死亡病例[2]。胰腺癌恶性程度高、侵袭转移能力强，且由于胰腺的解剖位置较深，早期临床症状隐匿不易诊断，超过85%患者初次诊断时癌细胞已经出现局部浸润或转移，预后效果不佳[3]。手术结合化疗是目前胰腺癌临床治疗的主要手段，但由于胰腺癌细胞的特性，传统化疗药物极易出现耐药性，因此，抗胰腺癌的新药开发迫在眉睫。中药及其活性成分具有良好的抗肿瘤作用。重楼为百合科植物云南重楼ParispolyphyllaSmithvar．yunnanensis(Franch.)Hand-Mazz.或七叶一枝花P.polyphyllaSmithvar.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎，主要分布于云南、四川、陕西等地，性微寒、味苦[4]。七叶一枝花为秦巴山区特色太白七药之一，为清热解毒类中药，用于治疗痈疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤等。现代药理学研究表明，甾体皂苷为重楼中发挥主要药效作用的成分，其苷元主要为薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元2类，重楼皂苷Ⅶ为具有偏诺皂苷元的皂苷类化合物，具有良好的抗肿瘤活性[5-6]。本研究考察了重楼皂苷Ⅶ对人胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移及侵袭的影响，为重楼皂苷用于抗肿瘤治疗提供基础。

1材料

1.1细胞

PANC-1细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

1.2药品与试剂

重楼皂苷Ⅶ（质量分数≥98%，批号?75?8）购自成都普菲德生物技术有限公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清、青链霉素混合液购自美国HyClone公司；四甲基偶氮唑蓝噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；Hoechst染料购自美国MedChemExpress公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；Transwell小室购自美国Corning公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒（批号）购自上海七海复泰生物科技有限公司；RIPA细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒购自陕西先锋生物科技有限公司；程序性死亡分子配体-1（programmeddeathligand1，PD-L1）蛋白抗体（批号）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗体（批号）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（polyADP-ribosepolymerase，PARP）抗体（批号）、DNA酶抑制物（inhibitorofcaspase-activateddeoxyribonuclease，ICAD）抗体（批号）、B细胞淋巴瘤-2（B-celllymphoma-2，Bcl-2）抗体（批号）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-associatedXprotein，Bax）抗体（批号）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）抗体（批号）购自美国Proteintech公司；羊抗鼠二抗（批号??）购自美国JacksonImmunoResearchLaboratories。

1.3仪器

型CO2培养箱、MultiskanGO自动全波长酶标仪、MicroPure超纯水机（美国ThermoFisherScientific公司）；IX73倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）；CJ-2S超净工作台（天津泰斯特仪器有限公司）；AXZH分析电子天平（美国OHAUS公司）；AccuriC6流式细胞仪（美国BD公司）；ChemiDocXRS＋化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2方法

2.1细胞培养

PANC-1细胞用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基，于37℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2重楼皂苷Ⅶ母液的配制

重楼皂苷Ⅶ溶于DMSO配制成mmol/L母液，分装保存于?20℃冰箱。临用时用DMEM高糖培养基稀释至不同浓度。

2.3重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞存活率的影响

取处于对数生长期的PANC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培养基重悬，以1×/mL接种于96孔板中，μL/孔，于培养箱中培养24h。设置对照组及重楼皂苷Ⅶ（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00、16.00μmol/L）组，弃去培养基，给药组分别加入μL不同浓度的重楼皂苷Ⅶ溶液，对照组加入不含药物的培养基，培养24h后，弃去培养基，PBS缓冲液洗涤2次，每孔加入μLMTT溶液（0.5mg/mL），于37℃孵育4h，弃去上清液，每孔加入μLDMSO，采用酶标仪测定nm处的吸光度（A），计算细胞存活率。

2.4重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞形态的影响

取处于对数生长期的PANC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培养基重悬，以1.5×/mL接种于6孔板中，2mL/孔，于培养箱中培养24h。设置对照组及重楼皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0μmol/L）组，弃去培养基，给药组分别加入2mL不同浓度的重楼皂苷Ⅶ溶液，对照组加入不含药物的培养基，培养24h后，弃去培养基，PBS缓冲液洗涤2次，加入2mL70%冰乙醇固定30min，PBS缓冲液洗涤，加入2mLHoechst染液（5μg/mL），避光染色15min，PBS缓冲液洗涤，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

2.5重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞迁移和侵袭的影响

2.5.1重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞水平迁移能力的影响取处于对数生长期的PANC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培养基重悬，以1.5×/mL接种于6孔板中，2mL/孔，待细胞贴壁后，弃去培养基。设置对照组及重楼皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0μmol/L）组，给药组分别加入2mL不同浓度的重楼皂苷Ⅶ溶液，对照组加入不含药物的培养基，于培养箱中培养，分别于0、12、24、48h在倒置显微镜下观察并拍照。

2.5.2重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞垂直迁移能力的影响Transwell小室置于24孔板中，取处于对数生长期的PANC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培养基重悬，以2×/mL接种于Transwell小室中。设置对照组及重楼皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0μmol/L）组，给药组Transwell小室下室分别加入μL不同浓度的重楼皂苷Ⅶ溶液（重楼皂苷Ⅶ母液以20%胎牛血清的DMEM高糖培养基稀释），对照组加入不含药物的培养基，于培养箱中培养24h。弃去Transwell小室中培养基，PBS缓冲液洗涤，甲醇固定20min，0.1%结晶紫溶液染色3min，PBS缓冲液洗涤，用棉签擦去小室内细胞，于显微镜下观察细胞。

2.5.3重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞侵袭能力的影响Transwell小室置于24孔板中，按照1∶3将Matrigel胶用预冷的无血清培养基稀释，40μL/孔，均匀铺于Transwell小室底部，于培养箱中孵育5h，弃去小室内残余液体。取处于对数生长期的PANC-1细胞，0.25%胰蛋白酶消化，用DMEM高糖培养基重悬，以4×/mL接种于Transwell小室中。后续操作同“2.5.2”项步骤。

2.6重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞凋亡的影响

取处于对数生长期的PANC-1细胞，以1.5×/mL接种于6孔板中，2mL/孔，于培养箱中培养24h。设置对照组及重楼皂苷Ⅶ（0.5、1.0、2.0μmol/L）组，弃去培养基，给药组分别加入2mL不同浓度的重楼皂苷Ⅶ溶液，对照组加入不含药物的培养基，培养24h后，弃去培养基，收集细胞，按照AnnexinV-FITC/PI双染试剂盒说明书染色，采用流式细胞仪进样分析。

2.7重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞Caspase-3、PARP、ICAD、Bcl-2、Bax和PD-L1蛋白表达的影响

取处于对数生长期的PANC-1细胞，以1.5×/mL接种于T25培养瓶中，培养24h，弃去培养基。设置对照组、重楼皂苷Ⅶ（1μmol/L）组，给药组加入2mL重楼皂苷Ⅶ溶液，对照组加入不含药物的培养基，分别培养0、12、24、48h，收集细胞，按照RIPA裂解液说明书提取蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质量浓度，加入上样缓冲液于℃加热变性。蛋白样品经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2h，洗涤后分别加入Caspase-3、PARP、ICAD、Bcl-2、Bax和PD-L1抗体，4℃孵育过夜，洗涤后加入羊抗鼠二抗，于室温孵育2h，洗涤后加入ECL发光液，采用化学发光成像系统曝光。

2.8统计学分析

实验数据以表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。3结果

3.1重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞存活率的影响

如图1所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组细胞存活率降低，呈剂量相关性，重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞的半抑制浓度（50%inhibitoryconcentration，IC50）值为（1.27±0.18）μmol/L，因此选择0.5、1.0、2.0μmol/L重楼皂苷Ⅶ进行后续研究。

3.2重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞形态的影响

如图2所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组细胞形态发生变化，出现颗粒状凋亡小体，镜下可见核浓缩和核碎裂。

3.3重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞迁移和侵袭的影响

如图3所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组PANC-1细胞迁移率显著降低（P＜0.01），且呈剂量和时间相关性；如图4所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组从小室上层透过聚碳酸酯膜进入下室的细胞数显著减少（P＜0.01），呈剂量相关性，表明重楼皂苷Ⅶ可抑制PANC-1细胞的迁移和侵袭能力。

3.4重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞凋亡的影响

如图5、表1所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ（0.5μmol/L）组中末期凋亡细胞比例显著升高（P＜0.01），重楼皂苷Ⅶ（1.0、2.0μmol/L）组早期凋亡细胞和中末期凋亡细胞比例均显著升高（P＜0.05、0.01）表明重楼皂苷Ⅶ可诱导PANC-1细胞凋亡。

3.5重楼皂苷Ⅶ对PANC-1细胞Caspase-3、PARP、ICAD、Bcl-2、Bax和PD-L1蛋白表达的影响

如图6所示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ组CleavedCaspase-3、PARP、Bax蛋白表达水平均显著升高（P＜0.01），pro-PARP、ICAD、Bcl-2蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05、0.01），且呈时间相关性，表明重楼皂苷Ⅶ可促进PANC-1细胞凋亡。如图7所示，重楼皂苷Ⅶ组PD-L1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01），呈时间相关性，表明重楼皂苷Ⅶ诱导PANC-1细胞死亡可能与下调PD-L1表达相关。

4讨论

胰腺癌侵袭性强，早期易转移，患者生存率较低。天然产物是抗肿瘤药物研发的重点来源[6]，从中药中寻找具有抗胰腺癌作用的活性成分具有重要意义。重楼皂苷Ⅶ为中药重楼中的主要活性成分，课题组前期研究发现重楼皂苷Ⅶ具有较好的抗肿瘤作用，能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移与侵袭，并可通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt）和核转录因子-κB（nuclearfactor-κB，NF-κB）通路诱导肿瘤细胞凋亡[7]。本研究结果显示，重楼皂苷Ⅶ可抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭，诱导PANC-1细胞凋亡。PD-1/PD-L1是一对免疫共刺激因子，PD-1表达于T细胞表面和初级B细胞表面，PD-L1作为其配体，在肿瘤细胞及浸润的淋巴细胞均有表达。正常情况下，PD-1通过PD-L1发挥免疫调控作用，PD-1/PD-L1通路的激活可减少免疫反应对正常组织的损伤，避免自身免疫疾病[8-9]。PD-1/PD-L1还可参与肿瘤免疫逃逸，其激活可降低肿瘤局部微环境T细胞的免疫效应，使肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤，促进肿瘤发生；阻断PD-1/PD-L1通路可逆转肿瘤免疫微环境，增强内源性抗肿瘤免疫效应[10]。肿瘤细胞能够通过上调PD-L1表达来逃避T细胞识别，从而逃避免疫杀伤[8,11]。本研究结果显示，与对照组比较，重楼皂苷Ⅶ可显著上调PANC-1细胞中凋亡相关蛋白CleavedCaspase-3、PARP、Bax表达水平，显著降低pro-PARP、ICAD、Bcl-2、PD-L1蛋白表达水平，表明重楼皂苷Ⅶ可诱导PANC-1细胞凋亡。综上所述，重楼皂苷Ⅶ能够抑制PANC-1细胞增殖、迁移和侵袭，诱导其凋亡，同时可能通过下调PD-L1蛋白表达参与免疫调节。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：何昊，刘杨，钱小英，靳曼菲，郑蕾，成昭．重楼皂苷Ⅶ对胰腺癌PANC-1细胞增殖、迁移与侵袭作用及机制研究[J].中草药,,52(7):-.

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