雷群英课题组BCAT2乙酰化能促进自身

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大家好，今天分享的文章来自年的SignalTransductionandTargetedTherapy，题为：AcetylationpromotesBCAT2degradationtosuppressBCAAcatabolismandpancreaticcancergrowth。文章的通讯作医院的雷群英教授，该课题组主要研究方向为肿瘤异常代谢。

主要内容：BCAT2（支链氨基酸转氨酶2）K44位点的乙酰化能够促进其自身的泛素化降解，降低细胞内BCAA水平，进而抑制肿瘤细胞的增殖。此外，作者还发现酰基转移酶CBP和去乙酰化酶SIRT4均能与BCAT2直接结合，结合后CBP能促进这种乙酰化，而SIRT4能够抑制这种乙酰化。

研究内容

赖氨酸乙酰化最初被发现于组蛋白，随后，许多的线粒体蛋白陆续被证明存在着赖氨酸乙酰化的翻译后修饰，有超过60%的线粒体蛋白均存在乙酰化位点。由于BCAT2是位于线粒体的催化BCAA(支链氨基酸)分解代谢的重要的酶（图1a），于是，作者针对BCAT2的乙酰化修饰及其功能展开了研究。

首先，作者将Flag-BCAT2转入HEK细胞，然后用赖氨酸乙酰化的特异性抗体进行WB实验，检测BCAT2的乙酰化水平，结果显示BCAT2的确被乙酰化（图1b），且给予去乙酰化抑制剂NAM/TSA后乙酰化水平提高（图1b-c）。之前的质谱数据显示BCAT2存在3个可能的乙酰化赖氨酸残基：K44，K，K。为了确认哪个是主要的乙酰化修饰位点，作者使他们逐个突变为精氨酸（精氨酸常被用于去乙酰化模拟突变），结果显示，K44位点的突变使BCAT2的乙酰化减少最显著（图1d）。为了验证K44位点的乙酰化修饰，作者构建了K44位点乙酰化的特异性抗体，dotblot分析显示，该抗体能很好的鉴定K44的乙酰化修饰（图1f）。Peptide-blocking实验也显示K44乙酰化的信号显著下降，K44乙酰化肽段的确与其抗体互作（图1g）。另外，IP实验的结果显示，给与去乙酰化抑制剂NAM后SW和PANC-1细胞中的K44位点乙酰化增加（图1h）。这些数据证明K44的确是BCAT2主要的乙酰化位点。

图1

接下来，作者探究了BCAT2乙酰化修饰的功能。首先检测乙酰化对BCAT2蛋白水平的影响。给予去乙酰化抑制剂，结果显示BCAT2水平显著下降（图2a-b），但mRNA水平没有显著变化，这说明蛋白水平的变化是由翻译后修饰引起的（图2c）。随后给予蛋白酶抑制剂MG，BCAT2水平回升（图2d），且K44突变显著降低了BCAT2的泛素化，这说明BCAT2的蛋白稳定性是由乙酰化通过泛素化蛋白酶调节的。此外，去乙酰化抑制剂增加野生型BCAT2的泛素化，但对K44R突变型没有影响（图2f），这进一步说明是K44位点的乙酰化促进了BCAT2的泛素化。有研究表明乙酰化对酶的活性有影响，于是作者检测了野生型与K44R突变型BCAT2的酶活，结果显示K44R突变并没有影响酶活（图2g）。这些数据表明乙酰化通过泛素化蛋白酶途径促进BCAT2的降解，且不影响其酶活。

图2

接下来，作者探究了支链氨基酸对BCAT2翻译后修饰的调节作用。剥夺肿瘤细胞的BCAAs以及谷氨酰胺，结果显示BCAT2蛋白水平显著下降，且蛋白酶抑制剂MG能够抑制这种下降（图3a-b），这表明BCAAs剥夺引起的BCAT2的降解是由蛋白酶体所调节的。接下来，作者探究了BCAAs剥夺是否会影响BCAT2的乙酰化水平，结果显示BCAAs的剥夺使野生型BCAT2的乙酰化显著增强（图3c-d），同样的，BCAAs剥夺促进了BCAT2的泛素化（图3e）。此外，CHXchase实验的结果显示K44R突变的BCAT2比野生型更稳定（图3f）。这些数据表明剥夺BCAA能够促进BCAT2乙酰化、促进其泛素化降解。

图3

为了探究促进BCAT2的K44位点乙酰化的乙酰转移酶，作者分别过表达HEK细胞的四种乙酰转移酶（p，CBP，PCAF，GCN5），结果显示CBP的过表达显著增加了K44位点的乙酰化水平（图4a），且使BCAT2蛋白水平显著下降（图4b）。此外，敲除CBP显著降低K44位点的乙酰化，且BCAT2蛋白水平增加，而过表CBP使BCAT2泛素化增加（图4c-d），His-BCAT2pull-down的结果显示二者存在直接的互作（图4e）。这些数据都表明CBP能使BCAT2的K44位点发生乙酰化进而促进其降解。

图4

由于去乙酰化抑制剂NAM能够抑制BCAT2的去乙酰化，作者推测SIRT家族或许能使BCAT2发生去乙酰化。作者依次过表达SIRT1-7，结果显示SIRT3和SIRT4能与BCAT2结合，且只有SIRT4能够增加BCAT2蛋白的水平（图5a），这说明SIRT4可能是BCAT2的去乙酰化酶。作者使SIRT4发生突变，结果显示野生型能增加BCAT2的乙酰化水平，突变型不能（图5b）。敲除小鼠的SIRT4，BCAT2的表达也降低（图5c）。此外，过表SIRT4使BCAT2的泛素化降低（图5d），CHXchase实验也显示SIRT4敲除使内源性BCAT2降解半衰期减小（图5e）。His-BCAT2pull-down的结果显示二者存在直接的互作（图5f）。这些结果均表明SIRT4是BCAT2K44位点的去乙酰化酶。

图5

最后，作者探究了BCAT2乙酰化对胰腺癌细胞增殖的影响。

用shRNA敲除AW的BCAT2，随后分别在细胞中重新表达野生型和K44突变的BCAT2（图6a），分别在BCAAs剥夺和充足的条件下检测细胞增殖情况，结果显示在BCAAs剥夺的条件下，BCAT2的K44R突变型肿瘤细胞增殖明显更快（图6b）、克隆形成更快（图6c）。此外，重新给予BCAAs后K44R突变型细胞吸收更多的BCAAs（图6d）。

接下来，作者分别将BCAT2WT以及K44R突变肿瘤细胞移植给小鼠，结果显示，在给予1/5BCAAs的条件下，K44R突变的肿瘤细胞生长显著更快（图6e），检测增殖的Ki67染色结果也显示K44R突变的肿瘤细胞在小鼠体内增殖更快（图6f）。这些数据表明，在BCAA剥夺的条件下，BCAT2的K44突变在体内外均能够使BCAT2更稳定并促进胰腺癌细胞的生长。

图6

总之，本文介绍了BCAT2K44位点乙酰化对胰腺癌细胞增殖的影响，提出在BCAAs剥夺的条件下，BCAT2的乙酰化修饰能够通过促进其泛素化降解而降低BCAT2水平，进而抑制肿瘤细胞的增殖。

撰写人：吴文惠

DOI:10./s---0

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