人参皂苷Rg3对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生

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摘要：目的探究人参皂苷Rg3对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管形成的影响。方法裸鼠背侧近右后肢处sc胰腺癌SW-细胞建立胰腺癌皮下移植瘤模型，将荷瘤裸鼠随机分为对照组及人参皂苷Rg3低、高剂量（10、20mg/kg）组。给药组ip人参皂苷Rg3，对照组ip0.9%氯化钠溶液，每2天1次，连续4周。给药结束3d后裸鼠脱颈椎处死，取瘤组织。采用免疫组化法检测各组裸鼠瘤组织中内皮细胞标记物CD31表达，计算微血管密度；采用qRT-PCR和Westernblotting法检测各组裸鼠瘤组织中血管内皮钙黏素（vascularendothelialcadherin，VE-cadherin）、络氨酸激酶受体A2（erythropoietin-producinghepatocellularreceptorA2，EphA2）mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组比较，人参皂苷Rg3组胰腺癌裸鼠皮下移植瘤质量显著降低（P＜0.05），微血管密度显著降低（P＜0.05），VE-cadherin、EphA2mRNA和蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05）。结论人参皂苷Rg3可能通过调控VE-cadherin、EphA2mRNA和蛋白表达，从而抑制胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管形成。

胰腺癌是临床常见的消化系统恶性肿瘤，发病率位居恶性肿瘤第7位，病死率位居第6位[1]。胰腺癌恶性程度高，由于其生物学特性，患者早期无特异性临床症状，病情进展迅速，部分患者就诊时已发展为晚期阶段，临床治疗效果不佳[1-2]。目前临床以手术、靶向、免疫等治疗及化疗为主[3]。研究发现，肿瘤新生血管的形成与机体血液循环有关，可促进肿瘤的生长、转移与侵袭[4-5]。因此，基于肿瘤新生血管的研究是开发抗肿瘤药物的新方向。人参具有显著的抗肿瘤作用，人参皂苷是其主要活性成分。人参皂苷Rg3具有抑制新生血管形成的作用[6-8]，临床常将以人参皂苷Rg3为主要活性成分的参一胶囊用于多种肿瘤的辅助治疗。本研究通过建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，考察人参皂苷Rg3对裸鼠肿瘤新生血管的影响，并探讨人参皂苷Rg3抑制胰腺癌新生血管形成的作用机制。

1材料

1.1动物

SPF级雄性BALB/C裸鼠，4～6周龄，体质量18～22g，购自中国科学院上海实验动物中心，合格证号SYXK（浙）-。动物饲养于温州医科大学SPF级屏障系统的洁净层流架内，温度（25±1）℃、相对湿度40%～60%，自由进食饮水。动物实验经温州医科大学实验动物中心伦理委员会批准（批准号wydw-）。

1.2细胞胰腺癌SW-细胞株购自美国ATCC。

1.3药品与试剂

人参皂苷Rg3（质量分数≥98%）购自上海博蕴生物科技有限公司；血管内皮钙黏素（vascularendothelialcadherin，VE-cadherin）抗体购自美国abgent公司；络氨酸激酶受体A2（erythropoietin-producinghepatocellularreceptorA2，EphA2）抗体购自美国RD公司；CD31抗体购自美国SantaCruz公司；山羊抗鼠生物素标记的抗体购自美国Earthox公司；DMEM培养基购自美国Gibco公司；荧光定量PCR试剂盒购自瑞士Roche公司；ECL化学发光法检测试剂盒购自美国Thermo公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司；免疫组化二步法试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物有限公司。

1.4仪器Elx型全自动酶标仪（奥地利KIALAB公司）；电泳仪、电泳槽（美国Bio-Rad公司）；型CO2细胞培养箱（美国Thermo公司）；TS倒置显微镜、E型照相机（日本Nikon公司）；Image-proplus6.0免疫组化彩色图像（美国MediaCybemetics公司）；GS-15R低温高速离心机（美国Beckman公司）。

2方法

2.1细胞培养

SW-细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中培养，细胞生长至70%～80%时进行传代。

2.2动物模型建立、分组与给药取处于对数生长期的SW-细胞，用DMEM培养基调整细胞密度为3×/L，于裸鼠背侧近右后肢处scμL细胞悬浮液，1周后，按照文献方法[9]，将荷瘤裸鼠随机分为对照组及人参皂苷Rg3低、高剂量（10、20mg/kg）组，每组8只。人参皂苷Rg3溶于生理盐水配制成质量浓度为lmg/mL的溶液，给药组ip人参皂苷Rg3，对照组ip0.9%氯化钠溶液，每2天1次，连续4周。给药结束3d后，裸鼠脱颈椎处死，取瘤组织，称定瘤质量并计算人参皂苷Rg3的抑瘤率。

抑瘤率＝(对照组平均瘤质量－给药组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量

2.3人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影响

各组瘤组织于4%多聚甲醛中固定48h，纵行切取瘤组织，于自动组织处理机处理并切片，采用免疫组化法检测血管标志物CD31表达情况。根据Weidner计数方法，镜下观察微血管呈棕色的单个或成簇细胞，在×光镜下寻找病灶微血管密度高的区域，在×光镜下随机计算5个视野下的微血管数，计算其平均值，作为肿瘤微血管密度。

2.4人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2mRNA表达的影响

按照Trizol试剂盒说明书提取瘤组织总RNA，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列：VE-cadherin上游引物5’-AAGCGTGAGTCGCAA-3’、下游引物5’-TCTC-CAGGTTTTCGC-3’；EphA2上游引物5’-GAGGGC-GTCATCTCCAAATA-3’、下游引物5’-TCAGACAC-CTTGCAGACCAG-3’；GAPDH上游引物5’-GAGT-CAACGGATTTGGTCGT-3’、下游引物5’-TTGATT-TTGGAGGGATCTCG-3’。

2.5人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表达的影响

取mg瘤组织，加入0.8mL裂解液研磨，于冰上孵育30min，40℃、r/min离心5min；超声裂解3次，40℃、r/min离心20min，取上清，采用BCA定量试剂盒测定蛋白质量浓度。蛋白样本经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2h，分别加入VE-cadherin、EphA2抗体，于4℃孵育过夜；TBS洗涤3次，加入山羊抗鼠生物素标记的抗体，室温孵育2h；TBS洗涤3次，加入ECL化学发光液曝光显像，采用AlphaEaseFC4.0软件分析结果。

2.6统计学分析

计量资料用表示，采用SPSS17.0软件统计分析，多组比较采用方差分析，两两比较采用t检验。

3结果

3.1人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤的影响

如表1所示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组荷瘤裸鼠皮下移植瘤质量显著降低（P＜0.05），呈剂量相关性。

3.2人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管密度的影响

如图1和表2所示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组皮下移植瘤微血管密度显著降低（P＜0.05），呈剂量相关性。

3.3人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2mRNA表达的影响

如表3所示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组荷瘤裸鼠皮下移植瘤中VE-cadherin和EphA2mRNA水平显著降低（P＜0.05），呈剂量相关性。

3.4人参皂苷Rg3对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin和EphA2蛋白表达的影响

如图2和表4所示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组荷瘤裸鼠皮下移植瘤中VE-cadherin和EphA2蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），呈剂量相关性。

4讨论

肿瘤转移与肿瘤的微血管生成密切相关，微血管生成可作为肿瘤转移、复发和预后的重要指标[10]。本研究结果显示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组荷瘤裸鼠皮下移植瘤质量降低，微血管生成减少，表明人参皂苷Rg3通过抑制荷瘤裸鼠皮下移植瘤微血管生成，从而抑制皮下移植瘤生长。局部的毛细血管基底膜降解，血管内皮细胞增殖并迁移，内皮细胞形成新的毛细血管。VE-cadherin仅在内皮细胞表达，是内皮细胞特异性标志物，在维持血管内皮细胞极性和完整性中发挥重要作用。VE-cadherin的表达与肿瘤的发生密切相关，VE-cadherin可促进内皮细胞向肿瘤病灶的黏附、迁移，促进病灶内新生血管的形成[11]，且与肿瘤体积呈正相关[12-13]。EphA2是Eph受体络氨酸激酶家族成员之一，在多种恶性肿瘤或细胞株中高表达[14]。EphA2与其配体EphrinA1结合后，激活下游胞质底物蛋白，在肿瘤新生血管形成中发挥重要作用[15]。阻断EphA2信号转导或阻断EphA受体酪氨酸激酶可抑制肿瘤血管生成[14]。研究发现，VE-cadherin可重新分布EphA2的配体，使EphA2与EphrinA1结合[16]。本研究结果显示，与对照组比较，人参皂苷Rg3组荷瘤裸鼠皮下移植瘤VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表达水平均显著降低，提示人参皂苷Rg3可抑制血管内皮细胞增殖、迁移，下调VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表达，阻止EphA2与其配体结合，阻断EphA2信号转导。

本研究表明，人参皂苷Rg3可抑制VE-cadherin、EphA2蛋白和mRNA表达，抑制瘤组织血管生成，从而提高荷瘤裸鼠生存质量。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来源：郭敬强，林胜璋．人参皂苷Rg3对胰腺癌裸鼠皮下移植瘤新生血管的影响[J].中草药,,52(6):-.

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