突破重新设计IL12以治疗胰腺癌

2021-6-5 来源：本站原创浏览次数：次

11月9日，郑州大学基础医学院王尧河课题组在NatureCommunications杂志发表题为“Re-designingInterleukin-12toenhanceitssafetyandpotentialasananti-tumorimmunotherapeuticagent”的研究论文，重新设计IL-12以提高其作为抗肿瘤免疫治疗剂的安全性和潜力（图1）。该文章第一作者为王鹏举博士。

该研究的突破在于对最凶险的胰腺癌有很好的疗效，能完全治愈腹腔散播的晚期动物胰腺癌。此外，论文首次报道了人白介素12在叙利亚仓鼠体内有生物学功能，为研究人白介素-12及相关机制和毒性选择合适的动物模型提供了科学依据。

图1

摘要：白细胞介素-12（IL-12）是抗肿瘤免疫疗法中最有效的药物之一，然而其潜在的致命毒性却限制了它在临床的应用。该研究的主要内容是将IL-12的N端信号肽删除，阻止其分泌到细胞外，从而达到既保留IL-12的抗肿瘤功效，又消除了其毒性作用的目的。该研究团队发现，在叙利亚仓鼠胰腺癌(PaCa)模型中，通过使用一种新设计的肿瘤靶向溶瘤腺病毒(Ad-TD)将非分泌nsIL-12特异性地运输到肿瘤细胞中，显著地增强了小鼠的生存并且治愈了胰腺癌的腹膜侵染，没有观察到毒副作用。这项发现为IL-12用于治疗癌症提供了新的希望。

Ad-TD-LUC选择性地在癌细胞中复制

首先构建了一个新型的肿瘤靶向复制腺病毒Ad-TD-LUC，将E1ACR2,E1B19K和E3gp19K基因删除部分区域，并将LUC开放阅读框（ORF）插入到E3gp19K区域。然后在正常细胞系和9种不同的癌细胞系中检测Ad-TD-LUC对肿瘤细胞的选择性复制能力。发现该新设计的肿瘤靶向复制腺病毒Ad-TD-LUC在正常细胞系中复制效率很低，但是在所有检测的癌细胞系中均有很强的复制能力。并且，在体内Ad-TD-LUC也表现出了只在肿瘤组织中高复制的选择性。因此新设计的Ad-TD-LUC选择性地在癌细胞中复制。

图2

Ad-TD-nsIL12能够在癌细胞中复制并具有肿瘤细胞毒性

在Ad-TD-LUC基础上又构建了两个溶瘤腺病毒载体，分别编码野生型IL-12(Ad-TD-IL-12)和非分泌型IL-12(Ad-TD-nsIL-12)。分别在人癌细胞系和叙利亚仓鼠癌细胞系中进行实验，检测病毒的效力。研究发现，在叙利亚仓鼠癌细胞系中Ad5和新构建的溶瘤病毒均能有效复制并在相同的时间点能达到同等复制水平。细胞增殖实验表明与Ad5相比，新构建的肿瘤靶向性腺病毒对癌细胞系有更明显的细胞毒性作用。

图3

改造后的IL-12不影响其自身生物学活性

为了检测人IL-12在胞内的聚集和分泌情况，在叙利亚仓鼠肿瘤细胞系中分别感染了Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12病毒，结果显示在感染了Ad-TD-IL-12的细胞上清中检测到了高水平的IL-12，感染了Ad-TD-nsIL-12的细胞上清中只有很低水平的IL-12，在细胞裂解液中检测到了高水平的IL-12，表明nsIL-12表达并聚集在细胞内。考虑到人IL-12在小鼠体内无功能活性，研究了人IL-12在叙利亚仓鼠免疫系统是否发挥功能。研究发现重组的人IL-12可以在体外诱导叙利亚仓鼠脾细胞表达TNF-α和IFN-γ，以及诱导外周血单核细胞的增殖。因此可以说明人IL-12在叙利亚仓鼠模型中具有功能活性，并且信号肽的确实并不影响其自身功能。

图4

Ad-TD-nsIL-12对皮下胰腺癌模型治疗有效

在建立的叙利亚仓鼠皮下胰腺癌肿瘤模型中检测了Ad-TD-nsIL-12的功效。在胰腺癌模型中分别注射Ad-TD-IL-12,Ad-TD-nsIL-12,Ad-TD-LUC或PBS，共注射6次，每次注射量为1×10E9PFU。结果显示注射Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12将IL-12靶向表达在肿瘤细胞，大大地限制了其自身毒性，从而%清除肿瘤，维持生存。成功的溶瘤病毒策略旨在不仅根除原发肿瘤，而且能诱导长期的抗肿瘤免疫。因此该团队将注射了Ad-TD-nsIL-12已经根除原发肿瘤的仓鼠再次感染HPD1NR胰腺癌细胞，研究观察到注射过Ad-TD-nsIL-12的仓鼠能够快速清除HPD1NR胰腺癌细胞，表明该仓鼠体内已存在对抗该肿瘤细胞的免疫应答。

图5

Ad-TD-nsIL-12能够安全地治愈侵染性胰腺癌

建立侵染性胰腺癌模型，可用于快速模拟晚期人胰腺癌。注射Ad-TD-nsIL-12能够保持%的生存率，直至实验结束，并且没有动物表现出治疗相关的毒性特征。注射Ad-TD-IL-12仅能保持10%的生存率，并且比PBS组死亡时间更早，减少注射剂量并没有得到任何改善。随后该团队又进行了肝功能毒性实验，注射Ad-TD-nsIL-12与PBS组持平，并不提高血清中天冬氨酸转氨酶(AST),丙氨酸转氨酶(ALT)和碱性磷酸酶(ALP)的水平。并且单次腹腔注射高剂量的Ad-TD-nsIL-12并没有导致治疗相关的死亡，所有治疗的动物在实验结束时完全被治愈。当治愈的仓鼠再次感染该肿瘤时，注射了Ad-TD-nsIL-12的仓鼠表现出了长期肿瘤特异性的免疫。

图6

Ad-TD-nsIL-12对原位胰腺癌模型治疗有效

Ad-TD-nsIL-12被用来进一步评估对原位胰腺癌的治疗效果，原位胰腺癌用来模拟临床上不可切除的病例。在该模型中，Ad-TD-nsIL-12显著提高了动物的生存率，Ad-TD-IL-12则由于IL-12介导的毒性导致快速地死亡。提高Ad-TD-nsIL-12的注射剂量能显著增加生存率，降低Ad-TD-IL-12注射剂量虽然减弱了毒性，但是生存率依然明显低于Ad-TD-nsIL-12组。

图7

Ad-TD-nsIL-12的功效依赖于CD8+T细胞

由于目前不存在功能性的仓鼠α-CD8+抗体，开发了一种仓鼠α-CD3+缺失抗体，CD3+CD4?实际应该是CD8+细胞群。注射了Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12后，免疫组化切片（IHC）显示皮下种植瘤中CD3+和CD4+浸润明显增多。注射Ad-TD-IL-12的脾脏中CD3+CD4?(CD8+)细胞群显著增加。注射Ad-TD-nsIL-12只瞬时增加局部引流淋巴结中的CD3+CD4+和CD3+CD4?(CD8+)细胞群，并不影响脾脏中的。表明nsIL-12更多地依赖于T细胞功能的改变而不是循环淋巴细胞总数的改变。

图8

Ad-TD-nsIL-12降低炎症细胞因子的表达

与注射Ad-TD-LUC或PBS相比，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12均能提高IFN-γ的水平，但是Ad-TD-IL-12比Ad-TD-nsIL-12提高IFN-γ的时间更早，水平更高。由IFN-γ诱导的趋化因子尤其是IL-2,IL-21,IFN-β,IL-12,和IP-10都反映了相同的模式。因此被Ad-TD-nsIL-12裂解的肿瘤细胞释放的IL-12也能刺激反应，但是减弱了炎症反应。更有趣的是nsIL-12并没有提高IL-6的水平，然而Ad-TD-IL-12却显著增加了IL-6的水平。IL-6水平增高通常与胰腺癌低生存率有关。

图9

王尧河教授简介

英国玛丽女王伦敦大学教授、肿瘤病毒基因治疗实验室主任、博士生导师。被聘为郑州大学河南省肿瘤病毒基因治疗学科特聘教授，任中英分子肿瘤学研究中心执行主任兼科技主管，郑州大学“重点学科”肿瘤生物治疗学术带头人；GeneTherapy和MolecularTherapy-Oncolytics杂志国际编委；在NatureBiotechnology、JournalofClinicalInvestigation等杂志发表学术论文60余篇，总影响因子超过，被引用超过次。其率领的科研团队在肿瘤病毒基因治疗领域取得了一系列的原创性研究结果，为开发新型肿瘤诊断和治疗方法提供了科学依据和方向。