文献解读文献单细胞RNA分析揭

Cross-speciessingle-cellanalysisofpancreaticductaladenocarcinomarevealsantigen-presentingcancer-associatedfibroblasts

CancerDiscovery

背景

丰富的非恶性间质成分是胰腺导管腺癌（PDAC）最重要的特征之一。其中，肿瘤相关的成纤维细胞（CAF）在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。前期研究显示，CAF生成的胞外基质成分能够支持肿瘤细胞的生存和迁移，并且能够干扰药物呈递。同时，CAF能够分泌多种细胞因子、趋化因子及生长因子，其自身生理结构也会影响免疫效应，是维持PDAC免疫微环境及免疫逃逸的重要机制之一。然而近年来针对CAF的一系列治疗尝试并未取得有效成果，相反对于胞外基质的破坏会进一步缩短实验动物的生存期。这些结果提示CAF内部可能存在不同亚群，其对肿瘤生存、发展的影响各不相同。为了进一步辨明CAF的亚群划分，并对不同亚群的分子特征进行定向描绘，该研究团队采用单细胞RNASeq的方式，针对人源和鼠源PDAC组织样本进行分析。

材料与方法

该项研究共纳入6名胰腺癌患者，取其手术切除组织样本，其中2名同时获取正常癌旁组织。患者来源于SidneyKimmelComprehensiveCancerCenteratJohnsHopkinsUniversity及MemorialSloanKetteringCancerCenter两所医疗机构。鼠源PDAC组织样本来源于KPC(Kras+/LSL-G12D;Trp53+/LSL-RH;Pdx1-Cre)小鼠。单细胞RNASeq采用10XGenomics体系。

结果

结果-1单细胞分析揭示人源PDAC细胞异质性

根据RNASeq结果，通过t-SNE算法针对高维数据进行降维聚簇，共识别出15个CellClusters，并根据特征性基因表达谱匹配每个Cluster的细胞类型。

整体来看，89%的细胞为免疫细胞，主要包括不同类型的髓系和淋巴系细胞。该结果提示，在类似实验条件下，免疫细胞更容易从PDAC组织中脱离。

CAF仅占整体细胞比例的1.75%。

结果-2胰腺导管细胞存在不同亚群

针对前述Cluster2，8，15（Ductalcell1，2，3）进行单独分析，重新划分出4个不同的CellClusters。

导管细胞经典基因特征（TFF1，TFF2，LYZ，VSIG2和CEACAM6）在Cluster1和4表达量较高。其中Cluster4同时高水平表达一群有别于Cluster1的基因。

Cluster2高水平表达与脂质代谢和加工相关的基因（如APOA1，FABP1和ADIRF）。Cluster3高水平表达与分泌蛋白（如SPP1，CLU，MMP7，CTGF，COL18A1）、腺泡蛋白（如CTRB2，CFTR）相关的基因。

不同亚群的导管细胞，在不同患者、癌或癌旁组织当中的细胞比例各不相同，呈现出明显的异质性。

结果-3胰腺癌的免疫抑制性微环境解析

针对髓系细胞进行单独分析，共划分出6个不同的细胞亚群，其中2个亚群（Cluster4和6）为肿瘤组织特有。整体来看，96%的细胞为单核细胞和巨噬细胞，剩余4%为树突细胞。

其中，Cluster4特征性表达MARCO及SPP1，两者均与巨噬细胞非炎性、免疫抑制性表型活化相关；Cluster5特征性表达IDO1，与T细胞增殖及细胞毒性抑制有密切联系。

针对T细胞和NK细胞进行单独分析，共划分出5个不同的细胞亚群，其中绝大部分CD4+细胞（Cluster2）及Tregs（Cluster3和5）均源于肿瘤组织。

Tregs特征性表达CTLA4及TIGIT，两者均能产生免疫抑制分子。

整体来看，多数细胞亚群均能介导T细胞的失活，呈现出免疫抑制性的微环境状态。

结果-4人源PDAC间质CAF的不同亚型

通过CD45，CD31及EpCAM等分子的抗体实现对免疫、内皮及上皮细胞的排除，单独分析CAF亚型，共聚类出2种亚型。

两种亚群共有的分子Marker：PDPN，DCN等。两者尚未被广泛报道为CAF的特异性Marker。其中PDPN被报道在一部分结直肠癌CAF中有表达，而DCN被认为是非恶性疾病成纤维细胞分泌的分子物质。

两种亚群中，其中一种（橙色）富集表达IL6，IL8等细胞因子，及CXCL1，CXCL2，CCL2，CXCL12等趋化因子相关基因，因此被定义为炎性CAF（iCAF）；另一种（绿色）富集表达ACTA2（编码alphasmoothmuscleactin，αSMA，成纤维细胞特异性marker），因此被定义为成纤维CAF（myCAF）。

除上述Marker外，该研究还发现了两种亚群其他的特异性Marker。例如iCAF中的CFD、LMNA、DPT，myCAF中的TAGLN、MYL9、TPM1、TPM2、MMP11、POSTN等。

结果-5KPC小鼠肿瘤组织的单细胞分析

鼠源胰腺癌组织分析同样形成多种亚群。与人源组织类似，髓系细胞占据绝大部分（87%）。差异表现存在于淋巴系细胞（B，Tcell）较少，与既往报道类似。CAF占比2%左右。

单独针对其中的CAF进行分析。共个CAF，共聚类出3个亚群。其中Cluster1和3与iCAF及myCAF的基因表达特征类似。Cluster1主要表达细胞因子、趋化因子等与免疫调节相关的基因，而Cluster3则主要表达与smoothmuscle相关的基因。

Cluster2基因表达谱与前述iCAF及myCAF均有差异。其主要表达MHCII家族基因，与抗原呈递细胞（APC）相关，因此被定义为抗原呈递CAF（apCAF）。同时Cluster2也表达与iCAF及myCAF同等水平的Col1a1、Col1a2、Dcn、Pdpn等成纤维细胞Markers，证明其成纤维细胞来源。

结果-6鼠源apCAF的存在性验证

通过RNA原位杂交技术，针对Pan-CAF的MarkerCol1a1及apCAF的特异性MarkerH2-Ab1转录本进行双染，发现确实存在部分同时染色的细胞，验证了apCAF的存在。

进一步，使用PDPN作为Pan-CAF的Marker，同时使用前期分析的apCAF特异性MarkerCD74进行免疫组化双染，同样发现存在部分同时染色的细胞。

通过流式细胞术，利用前期分析得到的iCAF特异性MarkerLy6C，以及apCAF特异性MarkerMHCII，使用相应抗体实现对不同CAF成分的分离。

iCAF占比44.4%，myCAF占比45.3%，apCAF占比10.3%。所有亚群差异性基因表达情况与前述结果基本一致。

结果-7人源apCAF的存在性验证

一些apCAF特异性marker，例如CD74以及HLA相关基因，均在人源CAF中有一定表达，其中20.9%的细胞共表达CD74及HLA-DRA，间接提示apCAF的存在。这部分细胞主要来源于原来认定的iCAF亚群中。

对人源胰腺癌组织进行流式质谱成像，发现确有少量细胞（箭头所指）共表达CD74、HLA-DR及CollagenI，进一步验证了人源胰腺癌中apCAF的存在。

结果-8apCAF的动态转换

将分离后的apCAF在体外二维平面进行培养，一段时间后，其分子特征与myCAF逐渐接近，提示apCAF可能是一群动态的细胞亚群，需要一定的环境来支持其独立亚群的状态。

结果-9apCAF具备向Tcell呈递抗原的能力

将APC，分离后的apCAF，iCAF及myCAF，与抗原OTII-specificOvalbuminpeptide及特异性CD4+T细胞进行共培养。17小时后，APC、apCAF均表达出TCR早期结合MarkerCD25/CD69，而iCAF及myCAF均无表达，证实apCAF具备一定的抗原呈递功能。

胰腺癌不同CAF细胞空间结构模式图及相应的特征性分子Marker。

讨论

本研究通过研究人源及鼠源胰腺癌组织的单细胞RNASeq数据，解析了不同物种细胞成分的差异及共性，创新性的提出了间质CAF的三种不同亚群，在分子层面对其特征谱进行了描述，并通过不同实验方法进行特征及功能验证。

该研究揭示了胰腺癌整体免疫微环境的复杂性，从机制层面对前期针对微环境改造治疗方式的失败提供了一定的改进方向。

结合针对其他不同癌种以及正常组织的研究，CAF的异质性是普遍存在的，并不是肿瘤特定的生物特征，需要进一步深入性地探索。

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