MolCancer去甲基化酶ALKBH5

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本期遗传学与整合组学课题组为大家带来的是年12月份发表在MolecularCancer上的“RNAdemethylaseALKBH5preventspancreaticcancerprogressionbyposttranscriptionalactivationofPER1inanm6A-YTHDF2-dependentmanner”一文，描述去甲基化酶ALKBH5通过调控YTHDF2依赖的m6A修饰介导PER1的转录后活性从而抑制胰腺癌发展的分子机制相关研究。

一

研究背景

胰腺癌(PC)已成为全球最常见的致死性肿瘤之一，5年生存率仅为8%。N6-甲基腺苷(m6A)是真核细胞中最普遍的表观转录组修饰，可调节多种生物学功能，比如RNA加工、核输出、翻译、降解和RNA-蛋白质相互作用等。目前，已有报道发现，ALKBH5为m6A修饰的去甲基化酶，可通过维持乳腺癌细胞的干性促进肿瘤发展；YTHDF2选择性识别mRNA的m6A位点调节mRNA稳定性。然而，ALKBH5和YTHDF2依赖性m6A修饰在PC中的病理作用仍不清楚。

二

简介

本研究发现，与正常组织相比，在PC样本中，ALKBH5表达较低。其次，通过体内外实验，研究者发现ALKBH5的过表达在体外降低了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭性能力，并在体内抑制了肿瘤生长，而ALKBH5的低表达则促进了肿瘤的生长能力。同时，进一步的研究表明，ALKBH5以YTHDF2依赖的m6A修饰调控了细胞内PER1mRNA的水平。此外，PER1mRNA水平的降低抑制了下游ATM信号通路，从而对细胞周期产生影响。同时，ATM通路中表达降低的p53又会进一步反馈抑制ALKBH5的表达，从而形成了一个转录调控环路。总之，这些发现揭示了去甲基化酶ALKBH5通过调控YTHDF2依赖的m6A修饰介导PER1的转录后活性从而抑制胰腺癌发展的新分子机制。

三

实验思路

四

研究结果

1.ALKBH5在PC样本中低表达

首先，通过qPCR、WB和免疫组化，研究者发现与正常组织相比，m6A去甲基化酶ALKBH5在PC中表达较低。同时，研究者发现低表达ALKBH5的PC中，m6A修饰明显降低。为进一步鉴定ALKBH5与PC之间的关系，研究者通过进行生存曲线分析，发现ALKBH5表达量较低的患者预后较差。因此，上述结果表明ALKBH5在PC中低表达，可将ALKBH5作为PC的预测和预后指标。

图1

ALKBH5在PC样本中低表达

2.ALKBH5的过表达降低了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭性能力

为进一步探索ALKBH5是否对PC的生长产生影响，研究者通过CCK8和克隆形成实验，发现敲低ALKBH5基因后，肿瘤细胞的增值能力明显升高，而过表达细胞内ALKBH5后，肿瘤细胞的增值能力明显降低。同时，通过体外的实验，研究者发现敲低ALKBH5基因后，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力明显升高，而过表达细胞内ALKBH5后，肿瘤细胞的迁移和侵袭能力明显降低。此外，为进一步探索ALKBH5是否对肿瘤细胞的细胞周期产生影响，研究者通过流式分析和WB实验，发现过表达ALKBH5基因后，细胞停滞在G2/M期的细胞明显增多，而敲低ALKBH5基因后，细胞停滞在G2/M期的细胞明显减少。总之，上述结果表明了ALKBH5抑制了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭性能力，并且阻滞了正常的细胞周期。

图2

ALKBH5的过表达在降低了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭性能力

3.ALKBH5的过表达抑制了体内PC的生长

为进一步探索ALKBH5在体内对PC的影响，研究者通过裸鼠皮下成瘤实验，发现过表达ALKBH5明显抑制体内PC的生长，而低表达ALKBH5明显促进体内PC的生长。此外，通过免疫组化实验，研究者发现过表达ALKBH5的瘤组织中与细胞增殖和转移相关蛋白表达明显降低，而低表达ALKBH5的瘤组织中与细胞增殖和转移相关蛋白表达明显升高。上述结果表明ALKBH5可对体内PC的生长产生抑制作用。

图3

ALKBH5的过表达抑制了体内PC的生长

4.ALKBH5以YTHDF2依赖的m6A修饰调控了细胞内PER1mRNA的水平

为进一步确定ALKBH5是如何参与调控PC的生长，研究者通过RNA-seq和m6A-seq，筛选出9个高甲基化水平的基因。接下来，进一步分析发现过表达ALKBH5，其中一个基因PER1的3`-UTR区高甲基化明显减弱，提示其可能为ALKBH5的靶基因。通过MeRIP-qPCR分析，研究者发现敲低ALKBH5基因后，肿瘤细胞内PER1的甲基化水平明显升高，而过表达细胞内ALKBH5后，肿瘤细胞内PER1的甲基化水平明显降低。此外，通过序列对比分析，研究者发现PER1甲基化修饰位点与YTHDF2结合位点临近。同时，通过敲低YTHDF2基因后，研究者发现PER1mRNA的水平明显升高。综上，上述结果表明了ALKBH5以YTHDF2依赖的m6A修饰调控了细胞内PER1mRNA的水平。

图4

ALKBH5以YTHDF2依赖的m6A修饰调控了细胞内PER1mRNA的水平

5.PC组织中的PER1具有肿瘤抑制作用

通过qPCR、WB和免疫组化，研究者发现与正常组织相比，PER1在PC中表达较低。同时，研究者通过进行生存曲线分析，发现PER1表达量较低的患者预后较差。因此，上述结果表明PER1在PC中低表达。此外，通过免疫荧光和临床样本分析及TCGA数据分析，研究者发现PC组织中PER1与ALKBH5的表达水平正相关。同时，通过CCK8等细胞表型实验，研究者发现过表达PER1能部分逆转ALKBH5敲减引起的细胞表型变化。上述结果表明PC组织中ALKBH5通过PER1对肿瘤发挥抑制作用。

图5

PC组织中的PER1具有肿瘤抑制作用

6.PER1诱导P53激活ALKBH5的转录

为进一步探索PER1影响PC的分子机制，通过WB实验，研究者发现敲低PER1基因能激活ATM信号通路，而过表达PER1蛋白后又能重新激活ATM信号通路。值得一提的是，研究者还发现细胞内过表达p53后，结果显示ALKBH5的水平显著升高，同时免疫组化分析显示P53高表达显著降低整体的m6A甲基化水平，表明了p53可促进ALKBH5的表达。此外，通过Chip和荧光素酶实验，研究者发现p53可与ALKBH5启动子区结合。综上，上述结果表明了细胞内PER1通过激活ATM信号通路内的P53表达升高，从而进一步促进激活ALKBH5的转录。

图6

PER1诱导P53激活ALKBH5的转录

五

总结与展望

目前，已有研究报道m6A修饰中的去甲基化酶ALKBH5在肿瘤的发生发展中发挥重要功能，比如乳腺癌和白血病等。然而，ALKBH5是否在PC中发挥作用仍不清楚。本研究首次揭示了去甲基化酶ALKBH5通过调控YTHDF2依赖的m6A修饰介导PER1的转录后活性从而抑制胰腺癌发展的新分子机制。

通过细胞表型实验、MeRIP-qPCR和RNA-seq以及m6A-seq等实验技术的结合，本研究阐述了PC中ALKBH5的低表达，促进了YTHDF2依赖的m6A修饰介导的PER1mRNA降解，表明了ALKBH5的缺失可作为PC的预测和预后指标。因此，该研究对于了解ALKBH5在PC中作用和分子机制以及PC的诊断和治疗具有重要意义。同时，本研究也发现ATM通路中表达降低的p53又会进一步反馈抑制ALKBH5的表达，从而形成了一个转录调控环路，表明了肿瘤组织中m6A修饰是一个复杂且高度调节的生物学过程，为进一步了解m6A修饰在肿瘤组织中作用机制提供了新思路。

END

文献分享者：赵曦

原文引用：DOI:10./s---w

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