外显子测序揭示胰腺癌的遗传多样性与治疗方

外显子测序揭示胰腺癌的遗传多样性与治疗方

发表期刊：NatureCommunication(IF=11.)

发表时间：.04.09

发表单位：美国西蒙斯癌症中心、德州大学西南医学中心

　　　　　　研究背景：

胰腺导管癌(PDA)是一种预后效果非常差的恶性疾病，需要深入了解该疾病的病因并开发靶向治疗策略。由于PDA肿瘤中存在大量基质细胞和炎症细胞，因此对来自于病人的肿瘤样本进行肿瘤细胞测序存在很大障碍，难以获得高质量数据。

　　　　　　研究目的：

研究目的：

由于胰腺导管癌(PDA)较难治愈，且治疗效果及预后都不理想，寻求基因遗传多样性，为发现PDA治疗靶点提供重要信息。

　　　　　　研究材料：

共个PDA患者样本，用显微切割方法获得肿瘤单细胞。

　　　　　　实验结果：

1.组织细胞的获取及突变的筛选

使用针尖切割的方法从胰腺癌上切割下具有代表性的一小块，进行外显子测序(图1a)。从突变中筛选出各基因的多种突变情况，包括错义突变、无义突变、插入、可变剪切等(图1b)。

最高频突变、前4种较高碱基的突变以及其他类型的突变频谱中各种碱基突变的频率不同，高频突变的碱基变化主要是GA，CT(图1c)。图1d是对图1c的统计与分类，包括患者抽烟与否、癌症类型以及临床上的分级。之后，具体分析了有抽烟史的患者、少量抽烟的患者以及没有抽烟史的患者，发现有抽烟史的患者GT的突变率是增加的(图1e)。抽烟患者的生存率要明显低于未抽烟的患者(图1f)。

图1PDA的遗传突变情况与疾病的病理特征

2.拷贝数变异(CNV)和Myc基因的作用

使用APC方法对CNV进行分类(图2a)，研究者发现5和6号群体与其他群体不同，具有较高的整体性，并且5和6号群体中除了TP53基因，其他基因发生的CNV是同源缺失(图2b)。5和6号群体的生存率也比其他分类群体要低(图2c)。通过对GISTIC分析得到染色体区域基因的扩增与缺失图谱(图2d)。之后，用生存曲线揭示了一条8号染色体长臂的某个区域内基因扩增与患者生存之间的关系：变异越高，患者生存率越低(图2e)。用MYC探针进行荧光原位杂交发现MYC基因会发生易位。

图2PDA上的CNV

3.胰腺癌细胞基因的突变与预后的关系

利用MutsigCV数据库对个样本的测序结果进行分析，发现了SNV及InDel突变的重要性(图3a)。研究发现了各基因的SNV及InDel的情况，其中KRAS与TP53基因的SNV与InDel频率最高。选取了2个重要的基因，并通过生存曲线发现，RBM10基因发生变异后，患者的生存率比不突变的要高很多，而ARID1A情况相反(图3b)。通过IHC实验对ARID1A染色验证，发现在一大批PDA样本缺失ARID1A蛋白，图3c是缺失ARID1A蛋白后的生存曲线图。

图3PDA中存在一些重要突变基因

4.KRAS通路上的基因遗传多样性

KRAS，BRAF，PIK3CA在各基因上的分布区域分别为12、13、61(图4a)。对pERK染色发现KRAS在12区域上表达高于61区域上的表达(图4e)。使用PLX-药物(抗癌药威罗菲尼)处理细胞样本，发现KRAS，BRAF及对照细胞pERK的情况不同，PL45(即KRAS突变)的表达量最高(图4f，4g)。图4h是验证这3个样的DNA合成情况，即检测细胞的周期进程，以及对细胞的活力验证及克隆能力的验证(图4i)，发现BRAF突变的细胞对PLX-药物的敏感性最强。

图4在PDA中的KRAS/BRAF的信号通路

5.胰腺癌中常见的突变通路

图5a显示的是各信号通路中一些关键基因突变的频率，这些突变对细胞的生长增殖具有重要的影响，一旦发生突变，形成癌症的概率将大大增加。图5b显示的是各信号通路对应的关键基因，这些基因在各自的信号通路中有着重要的作用。图5c显示的是通路富集上各基因的随机突变情况，以及图5d说明的是PDA中CNV的1和2号群体与其他群体之间的生存情况，这些结果表明了CNV群体的生存情况不同，1和2号群体的生存率要高于其他群体。

图5PDA中的信号通路

研究结果：

1.环境压力与DNA修复基因的改变具有相关性。

2.CNV会靶向多个肿瘤抑制/致癌基因位点，但MYC的扩增与PDA恶性程度和腺体亚型相关。通过测序分析，鉴定出了多个新生突变，对于治疗有着重要的作用。

3.RBM10突变与患者生存有着一定的关系，90%的样本发生了KRAS突变，但编码Q61密码子的基因与病人存活率增加具有特异性关联。

4.癌基因BRAF突变可以对抗癌药威罗菲尼的敏感性增强。

5.Wnt信号通路，染色体重构，hedgehog信号通路，DNA修复，细胞周期进程等都能观测到高频突变。

6.PDA新的遗传多样性，为这类疾病的治疗提供了一定的方法。

参考文献：

WitkiewiczAK,McMillanEA,BalajiU,etal.Whole-exomesequencingofpancreaticcancerdefinesgeneticdiversityandtherapeutictargets[J].NatureCommunications,,6.

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