胰腺癌nbspcfDNA的二代测序

一、摘要

患有胰腺癌和胆管癌的病人缺少个性化治疗方案的选择，部分原因是由于缺乏分子特征的活检手段，cfDNA测序或者使这类癌症的精准医疗成为可能。

作者尝试分析了26个病例肿瘤中的54个基因。肿瘤组织测序在9个病例中失败。在剩下17个病例中，90.3%的突变在肿瘤和cfDNA中都能够检测到。其中cfDNA测序的诊断精确度达到97.7%，其中对5个重要基因的检测灵敏度平均值达到92.3%，特异性达到%。在连续取样的样本中cfDNA的变化和肿瘤标记动态相关性较高。

因此报道认为cfDNA测序能够在未知肿瘤基因型的情况下可靠、精确并灵敏的反应肿瘤的突变类型或者预估ctDNA的丰度。由于肿瘤组织样本的不安全性、不可行性或不易获得的特点，cfDNA测序可作为诊断胰腺癌的一种方法。

二、简介

精准医疗在胆管癌和胰腺癌等疾病中的努力并没有获得相应的成功，主要是因为很难获得足够的组织样本进行二代测序。CfDNA测序在发现肿瘤来源的突变中的可靠性和精确性使这类致死疾病进行精准医疗成为可能。

腺导管腺癌是所有癌症中生存率最低的一种癌症。而且利用基因组分析进行PDA（胰腺胆管腺癌）诊断和治疗也是非常困难的，原因有两点：第一，检测样本中混有大量的基质细胞，第二，只有10%的PDA病人的肿瘤是可以切除的，并且即使把切除样本进行基因组测序研究，大部分也只有低于30%甚至更少的细胞具有突变。因此，在进行PDA研究时，大部分是围绕肿瘤来源的细胞系或肿瘤细胞的直接移植物进行测序，并且专家们目前没有就利用分子分析进行PDA诊断治疗给出任何建议。

在胆道系统癌症的平行研究及精准医学方面的努力也面临同样的困境。这些恶性突变通常带有可激活的突变，而且当这种突变被确定后也观察到了明显的反应，然而胆道癌通常是通过内镜逆行胆管造影中的胆管细胞刷进行诊断的，这经常产生分子检测样本不足的问题。因此虽然很多分子靶标出现，但是分子分析和靶向治疗都不是标准操作。

通过血液检测突变为这类疾病和其它多种疾病提供了可能的解决方法。晚期肿瘤经常释放大量的cfDNA进入血液，可以通过抽血进行无创检测对这些DNA进行PCR或二代测序检测。cfDNA测序可以避免昂贵、复杂及耗时等组织检测的缺点。另一项好处是可以通过的对cfDNA定量定性实现连续监测来源于肿瘤的突变的信息。

cfDNA在胰腺癌病人体内含量较高，但是并不知道有多少是来源于肿瘤的，多于75%的恶性PDA病人具有可用PCR方法检测的cfDNA。cfDNA中检测到的突变和PDA原发肿瘤及转移组织中所检测到的突变是否一致并不知道。另外，基于NGS的多基因panel如何用于胆道癌也是未知的。

本文设计了一个由前瞻性的临床研究，来解决cfDNA测序在胰腺癌病人诊断中的精度。这是第一次对这种致死率高的疾病进行此类研究，来确定肿瘤生物活检和血浆来源的cfDNA检测的结果一致性。

三、实验方案

本项研究共入组26个病例，其中18个是胰腺癌病人，8个胆道癌病人，另外有23个病例还发生了转移，实验方案如下：

四、实验结果

73个体细胞突变在26个病人的肿瘤组织和cfDNA的测序中都存在。对每个基因的突变频率进行计算，对7个突变频率最高的基因的突变状态进行了比较，发现KRAS和TP53是突变最多的基因，同时APC、SMAD4、GNAS、FBXW7和BRAF突变在cfDNA中也都有发现。

据上述结果将病人分为四组：一致（concordant），部分一致（partiallyconcordant），肿瘤突变cfDNA未检出（TND）和肿瘤组织不足建库测序（QNS）。来自13个患者的报告完全匹配，3个是部分匹配，1个是TND，还有8个是QNS。

有9个病人因为手术问题不能得到足够的肿瘤组织进行建库测序，用cfDNA测序发现7个病人存在基因突变，另外两个在血浆DNA样本中没有发现突变。

以组织检测结果为金标准对cfDNA检测结果的灵敏度和特异性两方面用大于一个病人的基因进行衡量。检测基因包括KRAS、TP53、APC、FBXW7和SMAD4。结果发现灵敏度从50%-%，平均为92.3%，特异性为%，平均诊断精确度为97.7%。只有KRAS和TP53在3个病人的cfDNA中检测到了突变。

在KRAS和TP53两个基因中共有26个突变被检测到，只有一个TP53在肿瘤检测中发现而在cfDNA检测中不存在（60号病人），68号病人中观察到3个TP53突变，有2个只在cfDNA中被检查出来，这有可能是转移后的亚克隆产生的。当白cfDNA作为金标准时，灵敏度、精确度和特异性都相似，说明这两种检测平台具有高度一致性。17个病例的肿瘤组织和cfDNA中共35个突变，其中有31个突变在肿瘤组织中检测到，28个通过cfDNA检测到。有7个突变则只在肿瘤组织测序中或cfDNA测序中发现。

为了检验cfDNA的突变频率与疾病进展或对肿瘤治疗的响应，检测了8个进行不同治疗病例的系列cfDNA的样本，同时对标准肿瘤标记和cfDNA中突变出现的频率进行系列比较，同时，突变每个病人的突变最多的cfDNA片段与其肿瘤标志无进行对比。在8个病人的19次连续抽血样本中，肿瘤标志物和cfDNA的量是一致的。另外，随着时间的推移，cfDNA中突变片段的百分比与肿瘤标志物的量高度相关。这一数据说明cfDNA中突变等位片段的的变化反应了随着时间进展，肿瘤负担的变化。

五、结论

总之，cfDNA测序在晚期胰腺癌病症诊断中是很有希望的一种手段，在临床上对cfDNA诊断方法的应用在提高检出活性突变方面要优于实体瘤检测，并且不会为病人带来很沉重的经济负担。在癌症治疗过程能够提供稳定可靠的突变检出使对此类疾病的治疗相对容易。而且此种方法还提供了在实体瘤检测失败的情况下对突变进行诊断的另一种手段。

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六、参考文献

OliverA.Zill,ClaireGreene,DraganSebisanovic,Cell-FreeDNANext-GenerationSequencinginPancreatobiliaryCarcinomas，CANCERDISCOVERY，DOI:10./-.CD-15-，。