TIGAR动态调控ROS调控胰腺癌的发生

DynamicROSControlbyTIGARRegulatestheInitiationandProgressionofPancreaticCancer

活性氧（ROS）在调节细胞行为的许多方面发挥着重要而多样的作用，从信号增殖和存活到促进氧化损伤和细胞死亡。ROS可诱导基因毒性损伤和慢性炎症，而通过NADPH氧化酶（如NOX4）产生的膜相关ROS是驱动增殖和转移的信号通路激活的重要因素。

线粒体活性氧也被证明是KRAS诱导的癌症发展所必需的。恶性进展的许多步骤与氧化应激增加和细胞对ROS诱导死亡的敏感性增加有关。

抗氧化防御途径的激活对于肿瘤的成功发展至关重要，这导致了一个改良的模型，在该模型中，ROS限制可能发挥作用，增强肿瘤的发生。许多研究已经证实肿瘤细胞天生就具有很高的氧化应激负荷，这反映了异常的致癌信号和正常环境的丧失。这些细胞的存活依赖于正常细胞不需要的伴随增加的ROS清除途径，这表明干扰这些抗氧化途径或仅仅增加ROS负荷可能选择性地杀死癌细胞。有趣的是，许多常用的化疗药物有效地诱导ROS。

肿瘤细胞限制活性氧暴露的许多机制已经被描述。其中最普遍的是NRF2的激活，NRF2是一种转录因子，调节参与抗氧化防御的基因程序。癌基因（如KRAS）的激活或环境信号（如缺氧）可诱导NRF2，有证据表明这种反应是肿瘤发展所必需的。在癌症发展过程中，通过蛋白质的过度表达或负性调节因子KEAP1的缺失直接激活NRF2是常见的。另一种促进ROS限制的蛋白质是TIGAR，一种具有双磷酸酶活性的蛋白质，可支持氧化戊糖磷酸途径（PPP）的激活以应对氧化应激，从而增强NADPH的产生以进行抗氧化防御。TIGAR限制ROS的功能已被证明有助于肠上皮损伤的解决，并保护免受脑缺血等病理损伤。然而，在许多癌症类型中也检测到TIGAR的高表达，这与抗氧化剂在肿瘤进展中的作用一致。

使用过氧化脂质的抗丙二醛（MDA）染色作为氧化应激的标记，我们证实Tigar-KOPanINs（KC和KFC模型）和Tigar-KO-PDAC（KFC模型）中的ROS增加。细胞系来源于三个Tigar野生型（C1，C2，C3）和三个Tigar缺失型（K1，K2，K3）KFC小鼠的肿瘤。与TIGAR的抗氧化作用一致，TIGAR-KO细胞系中线粒体ROS水平增加，并且可通过抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理而降低。Tigar-KO细胞在暴露于ROS诱导的化疗阿霉素（阿霉素）后也显示出增加的死亡，这受到NAC治疗的限制。重要的是，将重组TIGAR导入TIGAR空细胞可降低TIGAR-KO细胞中的ROS水平，也可挽救对阿霉素的敏感性。TIGAR已被证明支持通过氧化PPP的通量，后者产生NADPH用于抗氧化防御。氧化性和非氧化性PPP都产生5-磷酸核糖（R5P），先前的研究表明，这些表达PDAC的突变KRAS通过非氧化途径增加R5P的产生。有趣的是，在Tigar野生型细胞和空白细胞之间没有检测到R5P水平的一致性差异，这表明Tigar空白细胞中氧化PPP的任何缺陷都可以通过非氧化PPP通量的增加得到补偿。总之，这些结果表明TIGAR限制氧化应激，这一功能与TIGAR支持PDAC发育初期的能力相关。

许多研究和临床试验表明，活性氧既能增强也能延缓肿瘤的进展。本研究旨在阐明ROS在单一肿瘤类型胰腺导管腺癌的整个发展过程中的作用。

KRAS驱动的胰腺癌中Tigar缺失增加ROS并限制早期肿瘤进展

为了研究TIGAR在PDAC发生发展中的作用，我们利用建立良好的小鼠模型，使用Pdx1-Cre来驱动突变KRAS（LSL-KrasG12D/+）单独（KC）或突变KRAS与突变p53（LSL-p53RH/+；KPC）或p53缺失（p53fl/+；KFC）的胰腺表达。在KFC模型中，CRE介导的一个p53等位基因的缺失伴随着肿瘤发展过程中剩余的野生型等位基因的丢失。这些模型中的每一个都被杂交到一个Tigarfl/fl株中以产生保留Tigar表达（CTR）或删除Tigar表达（KO）的胰腺肿瘤。在KC模型中对癌前PanIN的初步分析表明，TIGAR的缺失延迟了PanIN进展的每个阶段的出现，同时伴随着Ki67染色测量的TIGAR空白病变的低增殖。使用KFC模型，可以更快地检测到PanIN病变，并且TIGAR的丢失再次延缓了PanIN的出现并降低了这些癌前病变的增殖。

PDAC中Tigar缺失促进转移并限制生存

KC小鼠的肿瘤进展相当缓慢，而KFC和KPC小鼠的PDAC发展更快。然而，令人惊讶的是，尽管PanIN发育延迟，TIGAR的缺失降低了KPC和KFC小鼠的存活率。CTR和KO原发性肿瘤的分化状态没有明显差异，但伴随着广泛的肿瘤扩散到多个器官。CK-19染色证实肺部病变代表PDAC的转移扩散。在KPC模型中，大多数CTR小鼠表现出转移的迹象，TIGAR丢失的额外影响没有达到显著性。然而，Tigar缺失显著增加了有转移证据的器官总数。在转移较少的KFC模型中，TIGAR缺失导致携带转移的小鼠明显增多，肺部病变数量显著增加。为了支持这些观察结果，KPC肿瘤中抗氧化防御蛋白NRF2的缺失（已被证明由于ROS的增加而减少潘宁的形成）也未能延长总生存期和无PDAC生存期，反而促进了肺转移的增加

TIGAR缺乏促进支持侵袭表型的Erk信号的激活

与CTR细胞相比，对pNF-κB、pSRC、pSTAT3、pSTAT3和HO1表达的分析未能证明TigarKO细胞中NF-κB、SRC、STAT3、AKT或缺氧途径的令人信服和一致的上调。此外，由HIF1靶基因（如GLUT1和BNIP3）编码的蛋白质的表达没有一致的变化。先前的研究表明，TIGAR的缺失导致肺癌细胞系中MET表达的降低，但我们无法检测我们的PDAC细胞中MET表达的任何差异。最近的研究也表明，ROS增加导致BACH1降解以限制转移，但这在TIGAR空PDAC细胞中并不明显。这些数据表明MET或BACH1表达的直接调节在我们的模型中对TIGAR丢失的反应中不起作用，尽管它们并不排除这些信号通路的更广泛参与。相比之下，TigarKO细胞中磷酸化ERK明显增加，同时DUSP6/MKP-3表达降低，这是负责去磷酸化和失活ERK的磷酸酶。这种表达变化与这些细胞中E-钙粘蛋白到波形蛋白表达的转换有关。在体内的PDAC损伤中也观察到类似的pERK增加和DUSP63表达减少。一致地，使用MAPKK抑制剂PD抑制ERK信号通路导致Tigar缺失的PDAC细胞恢复到更上皮的表型。此外，在NRF2缺失的PDAC肿瘤中也观察到磷酸化ERK的类似增加。

活性氧在TIGAR缺乏诱导的亲迁移表型中的作用

活性氧依赖于PDAC的形态和功能的控制是高度塑性的。TigarKO细胞恢复上皮形态，并减少长期抗氧化治疗的迁移/侵袭，在去除抗氧化剂后能够恢复这些特征。综合以上结果，这些结果表明，TIGAR丢失时ROS的增加可促进间充质转移，同时增加侵袭能力，但调节ROS水平可使肿瘤细胞在两个表型之间切换。

体内抗氧化剂可减少Tigar缺失细胞肺转移

为了直接检测TIGAR和ROS调节的缺失是否对转移能力有影响，我们建立了一个实验模型，在模型中，评估尾静脉注射后肿瘤细胞的肺定植。Tigar缺失PDAC细胞与Tigar野生型细胞相比，肺定植能力明显增强，而Tigar野生型细胞在NAC治疗后肺定植能力下降。正如预期的那样，TigarKO转移显示ROS（通过MDA染色测定）增加，而NAC治疗后限制ROS。与细胞系的结果一致，Tigar空肺病变中检测到DUSP6表达减少和磷酸化ERK增加，NAC逆转了这种反应。然而，有趣的是，Tigar-KO肺沉积物的增殖率明显低于Tigar野生型病变中的增殖率，这种反应在某种程度上也被NAC治疗逆转。虽然这些数据与ROS驱动的Tigar缺失PDAC细胞在尾静脉注射后对肺进行定植能力的增加一致，但增殖的减少可能表明，维持高ROS水平会在该部位建立细胞后对肺病变的增殖产生不利影响。

肿瘤进展过程中TIGAR表达的动态变化

在PDAC肿瘤发生的不同阶段对TIGAR进行的免疫组织化学分析表明，在KFC小鼠模型和人类PDAC样本的肿瘤发展的早期阶段，TIGAR表达增加，与TIGAR在限制ROS和促进这些侵袭前细胞存活方面的作用一致。然而，在小鼠和人类癌症中，浸润性原发肿瘤的进展伴随着TIGAR表达的明显降低，这与在这些肿瘤发生阶段选择具有更高活性氧和更高侵袭能力的细胞一致。有趣的是，在这些肿瘤的转移性沉积物中发现TIGAR水平略微增加，这与TIGAR再表达在限制ROS和支持已确定的转移中的增殖的作用一致。对不同肿瘤分期的活性氧水平分析表明，PDAC病变中高活性氧与低活性氧之间存在着预期的相关性，晚期活性氧积累较高，浸润性肿瘤表达较低的活性氧水平。

利用胰腺导管腺癌（PDAC）模型，我们发现TIGAR对活性氧（ROS）的调控支持癌前肿瘤的发生，同时限制转移。PDAC细胞中ROS的增加驱动了一种表型转换，增加了迁移、侵袭和转移能力。这种开关依赖于MAPK信号的激活，并且可以通过抗氧化处理逆转。在小鼠和人类中，TIGAR的表达在PDAC发育过程中受到调节，癌前病变中TIGAR水平较高，而转移性肿瘤中TIGAR水平较低。

我们的研究表明，活性氧的时间，动态控制是恶性进展的基础，并有助于合理化有关抗氧化剂治疗的促肿瘤和抗肿瘤作用的相互矛盾的报告。