肿瘤来源外泌体抑制胰腺癌患者NK细胞功能

前言

胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的恶性肿瘤之一。肿瘤衍生的细胞外囊泡（EV）诱导转移前的生态位形成以促进转移。6月22医院内科和肿瘤外科团队在Cancers点击查看影响因子上发表了“Tumor-DerivedExtracellularVesiclesInhibitNaturalKillerCellFunctioninPancreaticCancer”，文章通过超速离心从高转移性胰腺癌细胞系和患者来源的原发癌细胞中分离出EV。通过质谱法分析EV的蛋白质含量;通过流式细胞术研究PDAC衍生的EV对天然杀伤（NK）细胞的影响;通过ELISA定量血清EVs的TGF-β1水平，发现整合素富含PDAC衍生的EV。与EV共培养后，NK细胞中NKG2D，CDa，TNF-α和INF-γ的表达显着下调.NK细胞还表现出CD71和CD98水平降低，以及葡萄糖摄取能力受损。此外，NK细胞对胰腺癌干细胞的细胞毒性减弱。此外，PDAC衍生的EV诱导NK细胞中Smad2/3的磷酸化，PDAC患者血清EVs的TGF-β1显着增加。研究结果强调了PDAC衍生的EV的免疫抑制作用，并对PDAC中转移前生态位形成的NK细胞功能障碍的理解提供了新的见解。

研究思路

Figure1：胰腺癌细胞衍生的细胞外囊泡（EV）的表征。（a）通过透射电子显微镜（TEM）得到的胰腺癌来源的EV的代表性图像。（b）通过纳米颗粒分析（NTA）测定胰腺癌衍生的EV的大小。（c）通过蛋白质印迹法测定L3.6pl衍生的EV和亲代细胞的外泌体标志物ALIX，flotillin-1，TSG，CD9，CD63，CD81和Rab5的表达。（d）通过流式细胞术分析在与羧酸盐珠偶联的L3.6pl衍生的EV上的CD63表达。

Figure2：胰腺癌衍生的EV的蛋白质组学分析。（a）TBO衍生的EV和L3.6pl衍生的EV中的蛋白质的细胞组分。（b）胰腺癌衍生的EV中鉴定的蛋白质的分子功能。（c）胰腺癌衍生的EV中鉴定的蛋白质的生物学过程。

Figure3：胰腺癌衍生的EV携带粘附分子。（a）L3.6pl衍生的EV和TBO衍生的EV中的粘附分子的图。（b）整合在L3.6pl衍生的EV和TBO衍生的EV中。（c）L3.6pl衍生的EV中ITGAV的Western印迹分析。（d）通过共聚焦显微镜分析用PKH67标记的L3.6pl衍生的EV注射的肝脏。

Figure4：胰腺癌衍生的EV损害天然杀伤（NK）细胞功能。（a）来自GSE数据集的胰腺癌中肿瘤组织（T）和非肿瘤组织（N）中代表性免疫调节因子的相对mRNA表达.（b）nectin-2，PVR和表达通过蛋白质印迹在L3.6pl衍生的EV和L3.6pl细胞中测定TGF-β1。（c）使用共聚焦显微镜分析由NK细胞摄取的胰腺癌来源的EV。（d）用PBS或L3.6pl衍生的EV处理NK细胞。通过流式细胞术分析NKG2D阳性NK细胞的百分比。（e）用PBS或L3.6pl衍生的EV预处理的NK细胞与L3.6pl细胞以1：1的比例共培养。通过流式细胞术分析NK细胞中CDa（左），IFN-γ（中）和TNF-α（右）的平均荧光强度（MFI）。（f）用PBS或L3.6pl衍生的EV处理NK细胞。然后通过流式细胞术分析NK细胞以确定CD71（左）和CD98（中）和2-NBDG掺入（右）的MFI。

Figure5：胰腺癌衍生的EV抑制NK细胞对癌症干细胞（CSC）的细胞毒性。（a）使用qRT-PCR在贴壁细胞和球体中基因表达NKG2D配体。（b）通过流式细胞术测定贴壁细胞和球体中MICA/MICB的MFI。（c）没有NK细胞杀伤的肿瘤球的代表性图像（左），未处理的NK细胞杀伤后的肿瘤球（中）和L3.6pl衍生的EV预处理的NK细胞杀伤后的肿瘤球（右）。（d）没有NK细胞杀伤的肿瘤球的数量，未处理的NK细胞杀伤后的肿瘤球，以及L3.6pl衍生的EV预处理的NK细胞杀伤后的肿瘤球。

Figure6：胰腺癌衍生的EV通过TGFβ-Smad2/3信号通路抑制NK细胞功能，并且胰腺癌患者的血清EVsTGF-β1增加。（a）在存在或不存在SB-的情况下与TGF-β1或L3.6pl衍生的EV共培养后，通过流式细胞术测量NK细胞中SMAD2/3的磷酸化水平。（b）免疫组织化学（IHC）结果显示PDAC的肿瘤组织中TGF-β1过表达。（c）健康对照和PDAC组中每克血清EV的TGF-β1的量。

讨论

胰腺导管腺癌是最致命的恶性肿瘤之一。转移在PDAC中占癌症相关死亡的大多数。最近，已经提出转移前的生态位来阐明许多癌症实体中器官特异性转移过程的机制，例如黑素瘤，肺癌和胰腺癌。在过去的几十年中，EV在癌症的早期检测，诊断和治疗中引起了广泛的