肿瘤动物模型的构建胰腺癌篇

导语胰腺癌（Pancreaticcancer）是一种恶性程度很高的消化道肿瘤，由于患者在早期并无明显症状，直到晚期或转移时才被发现，预后极差，5年生存率不到7%，因此有了“癌中之王”的称号。目前胰腺癌发病的原因仍不明确，因此，建立准确的动物模型对于胰腺癌发生发展和药物开发十分必要。本文就为大家介绍胰腺癌的基本知识和常见动物模型的建立。

胰腺癌发病率和死亡率近年来明显上升，居所有肿瘤的前五位。如下图为在发达国家（美国），胰腺癌已成为第4种高致死率癌症，预测在未来十年将会成为第二大致死癌症。

预估年美国胰腺癌的死亡率

第一章胰腺癌的基本知识

胰腺癌在组织结构上可分为胰腺导管腺癌（占绝大多数）、腺泡细胞癌、骨髓癌、粘性非囊性癌、腺鳞癌、胰母细胞癌、未分化癌。约90%胰腺癌是指源于胰腺上皮内瘤变（PanIN）的胰腺导管腺癌（pancreaticductaladenocarcinoma,PDAC）。大部分患者被诊断为胰腺癌时年龄超过50岁，由于胰腺癌在早期没有明显的症状不易被察觉，通常在晚期才会被发现，因此预后极差。

胰腺癌的治疗手段

目前临床上手术是唯一可治愈的方法，然而一般发现较晚，丧失了根治机会，只有10%-15%的患者符合手术条件，并且80%接受切除及辅助治疗的患者将会复发并死于胰腺癌。晚期患者利用吉西他滨、吉西他滨和埃罗替尼联用、吉西他滨和白蛋白紫杉醇联用及放化疗来治疗胰腺癌，但是最终大部分患者因胰腺癌细胞转移到肝、肺、腹膜而死亡[1]。

胰腺癌的病因

在一些可预防风险因素中，抽烟、肥胖且缺乏运动、酗酒导致的慢性胰炎、肠胃溃疡和胃切除都与胰腺癌相关，同时10%的患者有胰腺癌家族遗传史。

胰腺癌的发病机制

胰腺癌始于胰腺正常细胞的基因突变，突变的基因通常有KRAS、CDKN2A、TP53、SMAD4等（下图b），积累的突变导致细胞恶性增殖突破基质膜到达周围的基质中，转移到肝、肺和腹膜中（下图c）。

胰腺癌发展过程[2]

第二章胰腺癌常用的动物模型

胰腺癌研究中主要用到的包括化学物质诱导、异种移植及基因工程小鼠模型。

一、化学物质诱导模型

致癌物质诱导模型应用最广泛的是：对叙利亚金仓鼠腹腔注射N-亚硝基(2-氧丙基)胺（BOP）；最近的方法是用偶氮丝氨酸（azaserine）、7,12二甲基苯并蒽（DMBA）在小鼠体内诱导胰腺癌发生[3]。如下图为许多致癌物质用于诱导不同动物种类胰腺癌的总结。

常用的致癌物诱导胰腺癌方法[3]

评价：该模型与人类胰腺癌组织结构上具有相似性，且它可通过诱导细胞凋亡、组织损伤、基因突变来刺激动物自发肿瘤形成。因此，致癌物质诱导动物模型仍可以作为一个有效的评价环境风险因素、饮食、化学预防在胰腺癌发生方面的工具。但是致癌物质常对动物其他组织器官有不良影响，且限制了涉及分子遗传学和通路分析的应用。

二、异种移植模型

移植模型主要分为2种，细胞移植CDTX和人源组织异种移植PDTX，下面依次介绍。

1.细胞移植CDTX

根据接种部位主要分为皮下和原位移植模型，首先了解一下常用细胞株。常用的主要有：CFPAC-1，BxPC-3，PANC-1，ASPC-1，MIAPaCa-2等细胞系。

小鼠品系选择要求：由于异种移植在有免疫能力的小鼠体内会产生排斥反应，因此一般选用免疫缺陷小鼠，如裸鼠（只缺乏T细胞）、严重免疫缺陷小鼠SCID（缺乏成熟的B、T淋巴细胞）、NOD/SCID（缺乏T、B、NK细胞）[4]。

1）皮下荷瘤

将肿瘤细胞注射到小鼠皮下成瘤。由于胰腺癌肿瘤细胞成瘤率较低，一般将细胞混有50%的Matrigel注射到裸鼠皮下可提高成功率。具体步骤参考往期皮下荷瘤视频。

评价：皮下荷瘤模型耗时短、花费低、操作简单，但是它很少会转移，且不会表现出由原位移植而引起的小鼠发病症状。

2）原位荷瘤

将肿瘤细胞注射到肿瘤起始发生的器官，经常伴随着肿瘤自发转移。具体操作如下：

1.准备luc-胰腺癌细胞悬液：50万细胞/μl-HBSS（包含1%的基质胶）；

2.用2%的异氟烷混合有2L/min的氧气麻醉裸鼠或NOD/SCID小鼠；

3.剃去小鼠左上腹的毛并将小鼠放置在它的右侧，用70%的乙醇擦拭小鼠左侧身体；

4.夹起腹部的皮肤并用剪刀在脾脏侧面的中间上剪一个1cm的切口；（图a）

5.用镊子钳抓住腹膜同样剪1cm的伤口，注意不要伤到下面的器官；（图b）

6.用钝头钳轻轻抓住胰腺的尾部的尖端，横向拉出胰腺/脾脏，使胰腺全部暴露出来；（图c）

7.将细胞悬液从冰上拿出并混匀，吸到注射器里；

8.将针头从胰腺的末端插到胰腺的中心部位，慢慢注射μl细胞悬液并撤回，观察针头拔出的泄漏情况并确认细胞悬液打到了胰腺内部；（图d）

胰腺癌原位荷瘤过程[5]

a.注射前的小鼠正常胰腺b.注射细胞悬液后的胰腺[5]

9.轻轻地用钝头钳将胰腺放回小鼠的腹腔，将腹膜和皮肤的伤口缝合；

10.将小鼠放到37℃加热板上继续监测小鼠体温、皮肤颜色和呼吸速度，小鼠醒后并回应外界刺激后将它们放到笼子里；

11.实时监测小鼠的肿瘤生长和健康[5]。

推荐大家可以参考JOVE的原位胰腺癌荷瘤视频，







































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