大盘点胰腺癌的基因和靶向治疗综述

NCI和SEER的数据显示胰腺癌5年生存只有5-6%，大多数患者诊断时都已是进展期，区域性和远处转移分别为27%和53%。胰腺癌治疗方面最近也没有突破性进展，含吉西他滨的治疗和手术是近10余年来的标准治疗，无论是用作新辅助还是辅助化疗，化疗选择很有限。美国Frank博士在Canlet杂志上介绍了个体化基因组医学在胰腺癌治疗上的应用。人类基因组计划（HGP）自年启动，于年提前完成，鉴定了大约30亿碱基对和大约24,基因，但是直至年通过Sanger测序技术才完成人类基因测序。1年后科学家采用快速测序技术检测基因组，花费仅为传统测序费用的百分之一，历时2个月完成。新的测序技术和巨大的数据信息，促进「个体化基因组医学」的发展。个体化基因组医学采用基因组信息提高诊断、指导分子和基因治疗选择，医师通过检查高危患者癌症相关基因变化，如高危患乳腺癌患者检查BRCA基因，来指导诊断与治疗。现代技术允许直接芯片分析唾液标本中的DNA，该技术核心是单核苷酸多态性（SNPs）。SNPs约占全DNA变化的90%，与免疫组化联合有助于鉴定恶性疾病中蛋白表达与功能异常，特别适合用胰腺癌。胰腺癌异质性很强，遗传学标志包括全基因组不稳定性，如突变、易位和插入/缺失、非整倍体。全基因组分析显示，12个核心信号途径皆有遗传学变化。最常见遗传学改变包括DNA复制，KRAS、TGF-β、凋亡和细胞周期途径改变。引起林奇综合征的MMR突变，引起遗传性乳腺-卵巢癌的BRCA突变，在胰腺癌特别是家族性胰腺癌中约占5–10%。胰腺肿瘤的遗传学改变能使得医师明确：（1）肿瘤对化疗、放疗或是手术的治疗反应；（2）细化治疗，如新辅助、辅助和基因治疗；（3）有效的药物使用方法。这些信息在临床上很重要，可以增加疗效、降低毒性、改善患者的生活质量。胰腺癌非常容易出现多药耐药，通过基因组学信息可以获得优化治疗的相关信息，还可以预测预后、减少不必要的治疗。胰腺癌标本可以通过如下手段获取：手术活检、内镜超声指引的细针抽吸（EUS-FNA）或循环中的肿瘤细胞（CTCs）。手术切除胰腺癌仍是活检金标准，而侵袭性较小的方法如EUS-FNA正在推广。但是FNA抽吸细胞难于在良性胰腺疾病中鉴别恶性损害，如慢性胰腺炎具有胰腺癌的细胞形态特征。CTCs来自原发或转移位置的肿瘤，可以由外周血分离获得，是潜在的胰腺癌标志。最近采用深度测序血清标本中KRAS突变情况，Yu等建立了方便快速的方法检查KRAS突变，敏感性87.5%，精确性92.9%，当肿瘤标本无法获得时这可能是特别有价值的一种检测方法，因为要改善胰腺癌诊断或早期诊断需要新的分子或遗传学标志。胰腺癌的基因组学对胰腺癌进展和其遗传学改变之间的关联已有很深刻的认识。年24例胰腺癌全外显子组测序显示，平均63个基因改变，多为点突变，KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4基因突变最常见。Biankin对例I或II期术前胰腺癌基因组测序，鉴定了16个明显的突变基因，包括ATM和MLL3。其它报告的基因有BRCA1、PDX-1和SLC39A4。胰腺癌中关键基因总结见表1。

表1胰腺癌的基因组学

KRAS突变存在于90%以上的侵袭性胰腺癌，与胰腺上皮内肿瘤（PanINs）进展为胰腺癌有关。KRAS是原癌基因，一旦有点突变活化，就能招募活化生长因子和受体信号，发生恶性转化；EGFR具有促进肿瘤细胞生长的作用，是KRAS的上游基因。结肠癌中如果KRAS活化，则靶向EGFR的药物无效，所以抗EGFR治疗之前进行遗传学检查十分必要。通过粪便标本和实时甲基化特异性多聚酶链反应（MSP）检测KRAS可能会成为胰腺癌的一种检测方法。此外血浆DNA测序可能为理解癌症发生、早期诊断提供新的认识，EUS-FNA允许医师活检胰腺癌以进一步对KRAS测序。从PanINs发展到胰腺癌的过程中，CDKN2A基因的缺失可以导致肿瘤抑制基因P16表达下调，在86-95%的散发胰腺癌中P16功能缺失发生在疾病早期。免疫组化显示淋巴侵犯和缺少P16表达之间存在明显的关联性。P16能抑制细胞增殖，突变后参与多肿人类癌症的发生发展。P53在PanINs发展到胰腺癌的过程中也经常发生突变，它参与细胞周期捕获、活化DNA、启动凋亡等过程。SMAD4/DPC4肿瘤抑制基因是晚发事件，它参与TGF-β介导的细胞生长调节，其缺失经常发生于转移性疾病，降低总生存（OS）。BRCA1/2是PanINs发展到胰腺癌过程中的晚期事件，它参与DNA修复。体外数据显示BRCA2有缺陷的人类胰腺癌细胞株对DNA损害高敏感，如PARP抑制剂。PARP家族，特别是PARP1和2与DNA单链修复密切相关，所以PARP抑制剂对BRCA1/2有缺陷的细胞有杀伤作用。PDX1控制胰腺的胚胎期发育，存在于正常成熟胰腺的β细胞中，在部分胰腺切除后和胰腺炎时PDX1可在导管细胞内重新表达，大约90%胰腺癌是导管腺癌，所以胰腺癌干细胞可能位于胰腺导管并表达PDX1，在恶性转化中发挥作用。PDX1主要在肿瘤浸润边缘和转移淋巴结中表达，与TNM分级、细胞增殖和降低生存有关。ZIP4是新的胰腺癌分子标志，它可以将锌转运入细胞，而ZNT家族则可将锌导出细胞。锌是许多酶的辅助因子，对高代谢和快速分裂的细胞很重要，如癌细胞。ZIP4在大多数胰腺肿瘤中过度表达，可能与胰腺肿瘤进展相关。小鼠模型显示ZIP4沉默降低肿瘤生长，过度表达促进肿瘤生长和转移。对42例胰腺癌组织采用Sanger测序，发现了ZIP4的变化，并鉴定了几处SLC39A4的SNP，部分SNP位于蛋白异构体1的启动子区域，可能会改变ZIP4表达。另只有一例胰腺癌组织存在蛋白异构体1密码子和蛋白异构体2密码子错义突变，由于发生频度低，可能是背景突变，还有几例肿瘤组织存在杂合性缺失（LOH）。ZIP4基因的错义片段可能会降低细胞对负性调节的反应，但需要功能分析证实这一假说；每个SNP也都需要进一步研究，确立其与蛋白功能的相关性。上述结果表明SLC39A4在胰腺肿瘤中突变并不明显，ZIP4野生型的过度表达可能有助于胰腺癌生长。EUS-FNA对评估胰腺癌是一项非常有前景的技术，这种技术侵袭性小，无需浪费大量资源，为遗传学和免疫组化检测提供标本。胰腺癌突变发生很快，迅速产生治疗拮抗，而EUS-FNA可以实时提供标本进行遗传学改变研究。联合FNA和遗传学检查可能会成为早期检测胰腺癌、优化治疗的有前景的方法。胰腺癌的药物基因组学遗传学影响药物治疗的相关知识有助于改善个体化治疗的有效性。年吉西他滨作为标准治疗，同5-氟脲嘧啶相比，可以改善疼痛控制和OS。吉西他滨是胞嘧啶的类似物和前药，在体内转化为活性代谢物，阻止DNA合成，但这种相互作用却可以因为RECQL基因的多态性而被打断，RECQL基因编码DNA解螺旋酶，吉西他滨进行活化代谢时必需穿过细胞膜并磷酸化，这个过程由hENT和hCNT核苷酸转运子完成。胰腺导管腺癌吉西他滨治疗后采用免疫组化方法检查，具有可检测和不可检测的hENT1者，中位生存时间分别为13个月和4个月，而且hENT1蛋白表达与辅助性吉西他滨治疗患者的OS和无病生存明显相关。低水平hENT1的患者可能不会获益于吉西他滨治疗，但是吉西他滨5′-反式油酸，也称作CO-1.01，可能是例外，该药是吉西他滨的脂肪酸衍生物，不需要hENT1转运其通过细胞膜。一项II期试验比较低表达hENT1患者对吉西他滨与CO-1.01的治疗反应，研究正在进行中。明确胰腺癌患者hENT1基因序列在临床上很有意义，因为一些亚组患者可能对吉西他滨更敏感，只要较低剂量治疗即可。鉴定hENT1启动子或外显子区域的突变可能会明确hENT1蛋白表达水平或功能状态的变化，并据此调整药物治疗剂量。CO-1.01可以作为治疗的另一种选择。吉西他滨的代谢能影响其治疗有效性，脱氧胞嘧啶激酶(DCK)和胞嘧啶核苷脱氨酶(CDA)影响治疗有效性，因为DCK使吉西他滨磷酸化为活性形式，CDA则将吉西他滨代谢为无活性形式。研究发现DCK低和高的胰腺癌患者OS分别为14.6和21.7个月，但DCK低者较高者至少年长10岁，说明年龄相关甲基化和表观因素可能会影响DCK水平。对人类胰腺癌细胞株评估，发现DCK的AG基因型对吉西他滨敏感性超过GG基因型，说明SNP可以预测吉西他滨有效性。一项CDA研究发现患者具有纯合CDA*3时CDA活性特别低，吉西他滨治疗产生严重毒性。FOLFIRINOX联合5-FU、伊立替康、亚叶酸和奥沙利铂是胰腺癌治疗的一大进展，同单药吉西他滨相比，增加IV期疾病OS4.3个月，但同时毒性也明显增加。FOLFIRINOX方案中包含5-FU，5-FU的代谢机制可能会影响个体化治疗。二氢嘧啶脱氢酶（DPD）是负责5-FU代谢的关键酶，一项研究中包括II期及以上胰腺癌，研究DPD表达与5-FU肝脏灌注化疗间的关系及OS，结果显示术后5-FU治疗患者，DPD水平低者较高者有生存获益。另有研究纳入例患者，二处DPD的SNPs，IVS14+1GA和AT与5-FU早期治疗毒性明显相关。总之基因组检查可预测毒性、确定精准的有效化疗剂量。药物运输的药物基因组学胰腺肿瘤药物输送屏障包括过多的纤维组织和致密的基质，后者主要由分泌的酸性蛋白和富于半胱氨酸（SPARC）造成，SPARC有多种功能，包括促进伤口愈合；通过调节基质沉积和转换、细胞粘附以及细胞外信号来介导细胞和微环境间的相互作用；还可抑制血管生成，参与上皮-间充质转化（EMT），诱导形态学变化丢失粘附特性。

SPARC在胰腺癌细胞株中可能是肿瘤抑制基因，因为shRNA抑制内源性SPARC能促进细胞生长，外源性SPARC抑制细胞生长和迁移。邻近原发胰腺肿瘤的基质纤维细胞表达高水平SPARC，可能参与结缔组织形成、降低血管密度和细胞侵袭。SPARC在邻近纤维细胞的表达通过肿瘤-基质相互作用调节，也可能通过旁分泌调节，可能是为了控制侵袭性肿瘤生长而作出的反应。

探索SPARC在胰腺癌中的作用可能会改善胰腺癌治疗模式。从正常组织到慢性胰腺炎组织，到非恶性组织，直至胰腺癌，SPARC基因甲基化（TRR）程度持续增高，已发现二个相对过度甲基化波峰，CpG区域1和CpG区域2。

正常胰腺中CpG区域1经常甲基化，而CpG区域2则极少甲基化，但在邻近胰腺癌的非恶性组织中CpG区域2的甲基化水平明显高于正常胰腺组织，而且高CpG区域2甲基化与大肿瘤、烟草、饮酒、慢性胰腺炎相关，所以有可能成为早期诊断胰腺肿瘤的标志。

另一个SPARC的检测方法是FNA活检，进行组织mRNA分析，这个方法很重要，因为不是所有的FNA标本都足够大、适合免疫组化检查。有研究发现SPARCmRNA高水平表达是明显的胰腺癌独立预后标志，低水平SPARCmRNA的胰腺癌5年生存率为20.24%，而高水平SPARCmRNA的患者5年生存率为0。以往的研究探讨了SPARC在运输药物中的作用，并比较了白蛋白紫杉醇联合吉西他滨与单药吉西他滨的疗效，结果显示白蛋白紫杉醇能增加肿瘤内吉西他滨的浓度，减少肿瘤周围纤维间质，这意味着白蛋白紫杉醇可能靶向基质SPARC并允许化疗药物运输进入肿瘤。SPARC对胰腺癌的作用仍不清楚，需要进一步研究其靶向胰腺癌治疗的潜能。抑制SPARC表达可能会阻止胰腺癌通过p53诱导的核蛋白1（TP53INP1）进行的侵袭，TP53INP1能上调p53并在体外减低细胞迁移。胰腺癌中它的表达缺失，而恢复表达后则可抑制胰腺肿瘤发展，胰腺癌细胞显示TP53INP1表达缺失者具有高度转移性。正常胰腺中miR-很低，允许TP53INP1抑制SPARC表达，并减少细胞迁移。在PanINl损害中，高水平miR-能下调TP53INP1并上调SPARC，增加细胞迁移。胰腺癌中miR-水平很高，TP53INP1完全阻滞，同时SPARC启动子过度甲基化，但胰腺癌细胞迁移能力仍有增加，是因为基质细胞过表达SPARC。其它与胰腺癌有关的几个基因如SLC39A4和PDX1等，有促进胰腺癌生长的作用。胰腺癌中ZIP4在复杂的信号网络中发挥作用，如miRNAs、细胞因子和锌依赖转录因子，小鼠胰腺癌模型中通过RNA干扰下调ZIP4发挥肿瘤抑制作用，靶向这些下游效应子的治疗可能会成为新的有效治疗胰腺癌的方法。PDX1也显示出治疗胰腺癌、胰岛瘤和胰岛恶性肿瘤的作用。特殊设计的RNA干扰效应子平台，是具有生物功能的shRNAPDX-1脂质体复合物，能迅速降低小鼠胰腺癌异种移植模型的肿瘤容积、增加生存。需要进一步明确，根据胰腺癌中ZIP4和PDX-1的改变进行的靶向治疗的安全性和有效性。总结基因组测序具有改善胰腺癌诊断与治疗的巨大潜能。近期遗传学研究明确了一些胰腺癌新的标志和治疗靶点，但是现有检查方法实践性不强。由于胰腺癌远期预后差，鉴定其遗传学改变的需求非常迫切，发现新的胰腺癌遗传学改变对改善胰腺癌的诊断、药物剂量的精确性及发现新的治疗手段非常有帮助。