循环外泌体中GPC1的检测可作为早期癌症

生物样本库BS小组

摘要：

外泌体是一种富含核酸和蛋白质，由细胞所分泌的脂质双层胞外运载体。所有的细胞均产生外泌体，且其循环于血液中。目前缺乏针对癌细胞来源的外泌体特异性的检测方法。应用质谱分析法，我们发现磷脂酰肌醇-1（glypican-1即GPC1），在癌细胞外泌体上表达丰富。应用流式细胞术在癌症患者及小鼠的血清中均观察到GPC1阳性的循环外泌体(crExos)。将健康人群和良性胰腺疾病患者作为对照组，早期和晚期胰腺癌患者作为病例组，发现在病例组中GPC1阳性的循环外泌体具有高度特异性和敏感性。肿瘤切除术前术后的肿瘤负荷与GPC1阳性循环外泌体表达水平具有相关性。KRAS致癌的患者和小鼠，其GPC1阳性循环外泌体中存在的突变KRASmRNA。MRI检测为阴性的肿瘤小鼠，其循环外泌体中GPC1阳性表达仍旧是诊断PanIN病灶的可靠指标。GPC1阳性循环外泌体将成为一种无创的诊断方法，从而筛查早期胰腺癌为手术治疗提供条件。

前言：

外泌体是直径50到纳米的脂包裹运载体。外泌体可由多种细胞释放进入血液循环（如免疫细胞、血小板和内皮细胞）。不同的癌细胞所分泌的外泌体具有不同的表达蛋白，包括四旋家族（CD9，CD63和CD81），转运复合体（ESCRT、TSG、Alix）和热休克蛋白（Hsp60、Hsp70、Hsp90）。上皮性肿瘤细胞分泌EpCAM阳性的外泌体，黑色素瘤来源的外泌体包含肿瘤相关抗原MART-1和酪氨酸酶相关蛋白2（TYRP2），胃癌、乳腺癌及胰腺癌来源的外泌体表达人表皮生长因子受体（HER），但以上这些并非特异。发现和分离外泌体中的特异性、无污染的DNA，RNA及蛋白质将有助于肿瘤的早期筛查及辅助治疗。

内容：

1.GPC1是癌细胞外泌体的特殊蛋白

通过高速离心法从人癌细胞（MDA-MB-人三阴性转移性乳腺癌），人皮肤成纤维细胞（HDF，NIH/3T3），以及非致癌性上皮细胞（MCF10A人乳腺上皮细胞，E10）分离出外泌体。并应用纳米粒子跟踪分析和透射电子显微镜(TEM)观察外泌体CD9表达情况，flotillin1和CD81则通过免疫印迹方法观测。对外泌体蛋白组学的分析应用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)。外泌体中蛋白质，包括标记物如TSG,CD9andCD63，在不同的细胞类型中均有表达，其中有48种蛋白质只在癌细胞中表达，且在多种癌细胞中表达，包括乳腺癌和胰腺癌。与非肿瘤细胞相比，癌细胞中的GPC1在转录和蛋白水平较高。其中GPC1+循环外泌体(crExos)增长与肿瘤负荷呈正相关（c;r=0.98,P=0.）。

2.GPC1+crExos作为肿瘤标记物

GPC1在小鼠肿瘤细胞外泌体和crExos中表达均为阳性，在乳腺癌患者和胰腺导管癌患者中GPC1+crExos均高于正常人群且差异显著（P0.）。

3.GPC1+crExos包含原癌基因KrasG12D

KRAS是被发现的导致胰腺癌基因突变和转录突变的高频基因。我们通过qPCR的方法检测外泌体中GPC1+和GPC1?crExos的mRNA，结果显示，Wild-typeKrasmRNA仅出现在GPC1+crExos中。

4.GPC1+crExos在胰腺癌早期诊断中的应用

实验证明GPC1+crExos可用作胰腺癌早期诊断，并可区分早期胰腺癌及良性肿瘤。应用GPC1+crExos区分胰腺癌四个阶段，BPD(良性胰腺癌)和健康者，ROC曲线的结果近乎完美，AUC为1.0(95%置信区间CI:0.-1.0)；敏感性为%(95%置信区间CI:98.1-%)；特异性为%(95%置信区间CI:97.1--%)；阳性预测值%(95%置信区间CI:98.1--%)；阴性预测值为%(95%:86.8--%）。相比之下，应用CA19-9区分胰腺癌患者和健康对照组(AUC为0.,95%置信区间CI:70.2--82.6%,P0.）。而且外泌体的浓度和大小亦是可以判断胰腺癌发病阶段的有效参数。所以GPC1+crExos可以作为诊断胰腺癌各个阶段的生物标记物。

5.GPC1+crExos可以表现出胰腺癌肿瘤负荷程度

通过应用GPC1+crExos评价胰腺癌转移性肿瘤负荷可知，GPC1+crExos在胰腺癌向远端转移过程中呈高水平表达，平均为58.5%，向淋巴转移为50.5%，无转移为39.9%。我们进一步应用GPC1+crExos评价肿瘤术后预后情况，可知在29名PDAC手术预后患者中以及所有PCPL患者血液中，GPC1+crExos表达呈明显下降趋势，(PDAC:P0.;PCPL:P0.）。而应用CA19-9进行检测发现，29名PDAC患者中仅有19名呈下降趋势，PCPL患者无表现(PDAC:P=0.;PCPL:P=0.81）。可见GPC1+crExos对肿瘤负荷程度评价效果更佳。

6.GPC1+crExos用于检测上皮内瘤病变

我们采用转基因小鼠模型PDAC(GEMM)评估GPC1+crExos的出现时间对肿瘤负荷的影响。在平均年龄为4周的PKT老鼠中，GPC1+crExos随时间增长（和肿瘤负荷）与疾病严重程度(组织病理学)的比例为8.4%，对照组为1.2%。

应用MRI来测量老鼠血流及GPC1+crExos含量，观察发现GPC1+crExos大小和浓度与肿瘤体积生长呈正相关（Pearsoncorrelationtest,r=0.67,P=0.,95%CI:0.–0.）。ROC曲线分析显示AUC为1.0(95%置信区间:0.75—-1.0)。

在横断面研究中，应用16-20天小鼠评估GPC1+crExos与肿瘤负担的关系。所有的PKT小鼠均检测到GPC1+crExos（PKT:8.3%,对照:1.8%）。但在组织学检测中，7只PKT小鼠有4只检测有早期上皮内瘤病变，另外三只并未检测到。另外，通过MRI我们并未检测到16-20天小鼠具有胰腺相关包块的出现。

展望：

肿瘤衍生的外泌体富含GPC1。而且，GPC1+crExos特异的带有Kras突变的mRNA。我们的实验结果显示了GPC1+crExos是一个可靠的诊断胰腺癌的生物标记物，它优于目前的检测标记物CA19-9，并且在MRI成像前即可检测到GEMM胰腺癌症病变。常规筛查如PDAC这种罕见疾病，MRI和CT昂贵且假阳性高，通过小鼠实验可知GPC1+crExos可作为胰腺癌的检测和监控工具，尤其是早期检测，但在临床实际应用上仍存在挑战。

目前根据CA19-9,CEA,CA-50,SPan-1，花生凝集素、DU-PAN-2、甲胎蛋白、组织多肽抗原和胰腺瘤胎抗原等生物标记物检测胰腺癌，不需要进行组织活检，但这些肿瘤标记物并不是特定的，不能分辨胰腺癌和胰腺良性肿瘤。由于诊断胰腺癌晚期只有大约15%的患者手术切除的肿瘤，缺乏用于胰腺癌早期检测的高敏感性和特异性的生物标记物是目前的一大挑战。

基因遗传学显示，癌症患者的循环DNA是由一些孤立的DNA组成的，这些DNA导致了细胞的基因突变和遗传缺陷，而DNA的流通则主要通过外泌体。基因突变往往与肿瘤的复杂性，治疗抵抗和复发呈高相关性，因此提供一个高敏感的，特异的，非创伤性的检测至关重要。GPC1是带有许多蛋白质且功能多样的一种细胞表面蛋白多糖，是癌细胞外泌体的标志物。观察胰腺细胞组织可知，许多癌细胞glypican-1过表达最为丰富，许多研究亦表明GPC1在PDAC的GEMMs检测起到重要作用。

因此通过GPC1+crExos检测分析癌症患者的DNA,RNA和mRNA，蛋白质，为胰腺癌早期检测和手术治疗提供一种更方便精准的选择。

作者：SoniaA.Melo

编译：马健博

校审：蒲春文

原文：

Glypican1identifiescancerexosomesandfacilitatesearlydetectionofcancer.Nature.Jul9;():-82.doi:10./nature.EpubJun24

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